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姜根茎中植源性凝乳酶的分离纯化、特性研究及其在奶酪生产中的应用

作　者: Malik Muhammad Hashim
导　师: 董明盛
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学与技术
关键词: 纯化特性生姜蛋白酶植源凝乳酶牛奶凝结作用奶酪蛋白水解
分类号: TS252.53
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

奶酪在人类饮食中有着悠久的历史。在古代,奶酪是牛奶延长货架期的一种主要产品形式。奶酪中的高脂肪和高蛋白让它成为一种高能量和富含营养的食物。如今,奶酪消费广泛分布在世界各地。凝乳酶是奶酪生产中一种最主要的活性剂。在凝乳酶的制备中,小牛皱胃酶是第一个,也是目前应用最广泛的。奶酪生产在世界范围内广泛增加,但随着小牛皱胃酶供应的减少、宗教原因(例如,伊斯兰教和犹太教)、饮食(素食主义)以及禁令基因重组小牛皱胃酶(在法国、德国和荷兰),使得对牛奶凝乳酶替代品有了更大的需求。通过基因工程细菌和霉菌生产的微生物皱胃酶已经被证明适合作为动物皱胃酶的替代品,但更令我们感兴趣的是一些植物来源的天然皱胃酶。由于动物皱胃酶的使用受到限制,所以植物凝乳酶的使用有助于提高这些人对于奶酪的生产。虽然一些植物来源的蛋白水解酶能够凝乳,但可惜的是用于生产奶酪的大部分植物皱胃酶的使用被认为是不恰当的,因为它的过度水解特性会降低奶酪最后的产量,同时也由于这种方式生产的奶酪最后会产生苦涩的口味,因而也限制了其使用。随后,为了满足工业良性增长以及顺应全球对多元优质的奶酪生产需求,从植物中提取新的牛奶蛋白凝乳酶的探索仍然在继续。该研究报告主要内容包括：(1)优化牛奶凝乳剂——姜蛋白酶的萃取条件,(2)从姜的根茎得到的新型牛奶凝乳剂——半胱氨酸蛋白酶的特性和纯化,(3)姜蛋白酶、木瓜蛋白酶和小牛皱胃酶对牛奶凝乳的影响,(4)在奶酪的生产过程中利用姜蛋白酶和小牛皱胃酶进行蛋白水解,(5)用姜蛋白酶和小牛皱胃酶制备的Peshawari奶酪的物理化学、微生物和感官特性评价。主要研究结果如下：(1)工艺参数的优化。即均质时间(1-3 min, X1),缓冲pH(6-8,X2),缓冲液体积(50-100 mL,X3),包括从姜的根茎液体提取得到的蛋白水解酶,通过响应面方法研究牛奶凝乳现象。二次模型应用于实验数据,我们得到了平均酶活性及其描述方程。将姜的根茎在76 mL, pH为7的缓冲液中均质2.4 min,得到最大的凝乳值(274 U/mL)。实验值和预测值无显著不同(P>0.05)。这些结果作用于优化提取过程,并且与奶酪工业生产标准化植物凝乳剂有显著相关性。(2)牛奶凝乳蛋白酶的纯化。利用硫酸铵分离、离子交换和排阻作用色谱技术,姜的根茎34.9%复原。经聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定纯化蛋白酶的分子质量为36 kDa, pI值为4.3。最终该酶被纯化约10.2倍。它是一种碳水化合物含量为3%的糖蛋白。这种纯化酶在pH值5.5,温度60℃表现出最大的活性。其蛋白酶活性被碘代乙酰胺、E-6、PCMB、Hg2+和Cu2+强烈抑制。N-terminal序列分类研究表明,抑制酶是半胱氨酸蛋白酶的一种。孤立酶的断裂能力高于αs-酪蛋白,β-酪蛋白和k-酪蛋白紧随其后。从先前报导的姜蛋白酶可知,不同的纯化酶,分子量、pI值、碳水化合物含量、N-terminal序列各不相同。这些结果表明,经过纯化的蛋白酶有潜在的能力作为皱胃酶的替代品应用在乳品行业。(3)用植物来源的姜蛋白酶和木瓜蛋白酶来研究对牛乳凝乳的影响。用比浊法来评估和比较用植源凝乳酶和小牛皱胃酶处理过的样品的凝乳能力的不同。通过对合成奶酪脱水收缩量和感官评价的研究,发现小牛皱胃酶和姜蛋白酶牛奶的浊度都呈现三个不同发展阶段的增长。姜蛋白酶和木瓜蛋白酶与小牛皱胃酶相比凝胶时间短,但是凝胶结束需要较长时间。这个从姜蛋白酶获得的凝乳酶有较高产量。除了味道和苦涩,整体感觉,在凝乳酶中特性没有表现显著不同。(4)对凝乳剂的类型,包括小牛皱胃酶(GP)或姜蛋白酶(CR)在奶酪形成的整个成熟过程中的影响进行了评价,结果表明在奶酪的生产中使用小牛皱胃酶更利于蛋白质的水解,在成熟60天后pH为4.6时,水溶性氮(WSN)、非蛋白氮(NPN)、氨基氮(NH3N)和氨基酸氮(AAN)的含量分别达到29.19%、9.86%、0.43%和0.59%,相比较使用姜蛋白酶生产的奶酪WSN、NPN、NH3N和AAN的量分别为18.23%、8.64%、0.46%和0.73%。使用小牛皱胃酶生产的奶酪降解得到α-酪蛋白、β-酪蛋白和γ-酪蛋白的量均高于使用姜蛋白酶生产的奶酪。但是,在利用姜蛋白酶生产的奶酪成熟过程中,前体α-酪蛋白更易于降解,而且在整个的生产过程中疏水肽、亲水肽以及二者的比例也明显高于小牛皱胃酶生产的奶酪,这些结果将进一步通过组成分分析(PCA)结果证实。(5)对用牛奶制成的Peshawari乳酪物化、微生物和感官特性进行检测,讨论了姜蛋白酶和小牛皱胃酶对于乳酪品质的影响。对于大多数的理化参数(脂肪、蛋白质、酸度、pH),主要的微生物种群(总菌群,肠杆菌,乳酸菌,霉菌和酵母菌)进行了研究,用不同的凝乳剂制成的乳酪呈现不显著(P>0.05)差异。然而,用姜蛋白酶制成的奶酪和小牛皱胃酶相比,水分的显著性呈现更低水平(P<0.05),水溶性氮(SN)呈现高水平(P<0.05)。用姜蛋白酶制备的Peshawari奶酪,主要的感官属性(外观、质感、气味)均显著提高(P<0.05)。重要的是,用姜蛋白酶制成的Peshawari奶酪没有苦涩口感。结果表明：姜蛋白酶在制造Peshawari奶酪上具有很大的潜力。

全文目录

ABSTRACT  10-14
摘要  14-17
LIST OF ABBREVIATIONS  17-19
LIST OF FIGURES  19-22
LIST OF TABLES  22-24
CHAPTER 1 Introduction  24-32
  Research goal and objectives  26-27
  References  27-32
CHAPTER 2 Literature review  32-64
  2.1. Ginger  32-33
    2.1.1. Habitat  32
    2.1.2. Culinary use  32
    2.1.3. Medicinal use  32-33
    2.1.4. Milk clotting properties of ginger  33
  2.2. Cheese  33-37
    2.2.1. General aspects  33-34
    2.2.2. Classification  34-36
    2.2.3. Composition of cheese  36
    2.2.4. Health benefits  36-37
    2.2.5. Production technology  37
  2.3. Casein  37-40
  2.4. Rennet  40-43
    2.4.1. Animal rennet  40-41
    2.4.2. Genetically engineered chymosin  41-42
    2.4.3. Microbial rennet  42
    2.4.4. Plant rennet  42-43
  2.5. Mechanism of milk gelation  43-45
  2.6. Biochemistry of cheese ripening  45-51
    2.6.1. Glycolysis  46-47
    2.6.2. Lipolysis  47-49
    2.6.3. Proteolysis  49-51
  References  51-64
CHAPTER 3 Extraction of milk coagulating protease from ginger rhizome:aresponse surface approach  64-80
  3.1 Introduction  64-65
  3.2. Materials and methods  65-69
    3.2.1. Materials  65
    3.2.2 Variables and their level selection  65-66
    3.2.3. Preparation of crude ginger protease extracts  66
    3.2.4. Milk clotting activity  66
    3.2.5. Experimental design  66-68
    3.2.6. Optimization and verification procedures  68-69
  3.3. Results and discussion  69-75
    3.3.1 Variables and their level selection  69-71
    3.3.2. Optimization procedure  71-73
    3.3.3. Model fitting  73-74
    3.3.4. Verification of the model  74-75
  3.4. Conclusion  75-76
  References  76-80
CHAPTER 4 Purification and characterization of milk coagulating protease fromginger rhizomes  80-104
  4.1. Introduction  80-81
  4.2. Materials and methods  81-86
    4.2.1. Materials  81
    4.2.2. Extraction and enzyme purification  81-82
    4.2.3. Protease activity  82-83
    4.2.4. Milk-clotting activity  83
    4.2.5. Determination of protein contents  83
    4.2.6. Electrophoresis and activity staining  83-84
    4.2.7. Isoelectric focusing  84
    4.2.8. Carbohydrate content  84
    4.2.9. Effect of temperature  84
    4.2.10. Effect of pH  84-85
    4.2.11. Effect of inhibitors  85
    4.2.12. Casein hydrolysis  85
    4.2.13. N-terminal sequence  85-86
  4.3. Results and Discussion  86-97
    4.3.1. Purification of the enzyme  86-88
    4.3.2. Homogeneity and molecular mass  88-89
    4.3.3. Carbohydrate content  89-90
    4.3.4. Effect of pH on the activity of enzyme  90-91
    4.3.5. Effect of temperature on the activity of enzyme  91-92
    4.3.6. Effect of inhibitors and metal ions on the activity of enzyme  92-94
    4.3.7. Casein hydrolysis  94-95
    4.3.8. N-terminal sequence  95-96
    4.3.9. Milk coagulation  96-97
  4.4. Conclusion  97-98
  References  98-104
CHAPTER 5 Assessment of bovine milk coagulation brought about by gingerprotease,papain and calf rennet  104-120
  5.1. Introduction  104-105
  5.2. Materials and methods  105-107
    5.2.1. Milk collection  105
    5.2.2. Coagulants  105
    5.2.3. Coagulation  105
    5.2.4. Syneresis capacity and speed of whey expulsion  105-106
    5.2.5. Measurement of turbidity and conductivity  106
    5.2.6. Physiochemical analysis  106
    5.2.7. Computation of cheese yield  106-107
    5.2.8. Organoleptic evaluation  107
    5.2.9. Statistical Analysis  107
  5.3. Results and discussion  107-114
    5.3.1. Physicochemical characteristics of expelled whey  107-108
    5.3.2. Turbidity during coagulation  108-110
    5.3.3. Milk conductivity  110-111
    5.3.4. Syneresis capacity and draining velocity  111-112
    5.3.5. Cheese yield  112
    5.3.6. Organoleptic evaluation  112-113
    5.3.7 Multivariate analysis (Principal component analysis)  113-114
  5.4. Conclusion  114-115
  References  115-120
CHAPTER 6 Proteolysis in cow milk cheese manufactured with calf rennet and gingerprotease  120-138
  6.1. Introduction  120-121
  6.2. Materials and methods  121-123
    6.2.1 Cheese manufacturing and sampling  121
    6.2.2 Nitrogen fractions  121-122
    6.2.3. Peptide analysis  122-123
    6.2.4 Electrophoretic analysis of casein  123
    6.2.5 Statistical analysis  123
  6.3 Results and discussion  123-131
    6.3.1 Changes in casein fractions (Primary proteolysis)  123-125
    6.3.2 Changes in nitrogen fractions (Secondary proteolysis)  125-127
    6.3.3 Changes in the HO and HI peptides  127-129
    6.3.4. Multivariate analysis  129-131
  6.4 Conclusion  131-132
  References  132-138
CHAPTER 7 Quality profiling of peshawari cheese manufactured with calf rennetand ginger protease  138-152
  7.1. Introduction  138-139
  7.2. Materials and methods  139-141
    7.2.1. Cheese manufacturing and sampling  139-140
    7.2.2. Physicochemical analyses  140
    7.2.3. Microbiological analyses  140-141
    7.2.4. Sensory evaluation  141
    7.2.5. Statistical analysis  141
  7.3. Results and discussion  141-148
    7.3.1. Physicochemical characteristics  141-144
    7.3.2. Microbiological characteristics  144-146
    7.3.3. Sensory characteristics  146-148
  7.4. Conclusion  148-149
  References  149-152
Conclusions  152-154
New knowledge  154-156
Research implication  156-158
Publications  158-160
Acknowledgement  160-161

姜根茎中植源性凝乳酶的分离纯化、特性研究及其在奶酪生产中的应用

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