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喹赛多临床前毒理学安全性评价

作　者: 方桂杰
导　师: 袁宗辉
学　校: 华中农业大学
专　业: 农产品加工与贮藏工程
关键词: 喹赛多 急性毒性 亚慢性毒性 致突变性 致畸性 繁殖毒性 安全性评价 喹乙醇
分类号: S859
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
下　载: 54次
引　用: 1次
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内容摘要


喹喔啉类药物作为饲料添加用抗菌促生长剂，曾在世界范围内广范应用，给人类社会带来了巨大的物质财富和社会经济效益。但由于特殊毒性问题，本类中的主要品种卡巴氧和喹乙醇已在很多国家和地区被禁止使用或严格限制使用。喹赛多为新一代喹喔啉类抗菌促生长剂，对食品动物具有良好的促生长效果。如其具有好的安全性，开发上市代替卡巴氧和喹乙醇，必将对畜牧业生产和人民生活水平的提高起到巨大的推动作用。为评价喹赛多的安全性，进行了系统的临床前毒性试验。测定喹赛多的急性毒性，致突变性，致畸和繁殖毒性，亚慢性毒性，对其致癌性进行预测，计算ADI（每日容许摄入量）和其在动物性食品中的安全浓度。为喹赛多作为新药审批提供毒理学资料，为其过渡到临床试验和应用提供剂量选择和毒副反应监测的依据。1急性毒性试验Wistar大鼠20只，雌雄各半，喹赛多用0.5％羧甲基纤维素钠（CMC）助溶制成混悬液，以1mL／100g b．w．的容量在24h内灌胃3次。观察28d内的中毒反应。结果表明仅给药后大鼠粪便呈黄色，为黄色的试药随粪便排出所致。大鼠未出现明显的中毒反应和死亡。喹赛多对Wistar大鼠的经口MTD＞13g／kg b．w．，按照急性毒性分级标准喹赛多属实际无毒物质。2遗传毒性研究鼠伤寒沙门氏菌回复突变（Ames）试验试验菌株为TA97，TA98，TA100，TA102。进行了2次试验，第1次试验剂量为5，10，25，50，100，250μg／皿，用已知的阳性物作阳性对照，同时设溶剂对照（二甲亚砜（DMSO））和空白对照（蒸馏水），加和不加S9混合液的对照。每个处理作3个平行平皿，采用标准平皿掺入法，计数各皿回变菌落数，结果评价为计算各处理平均每皿诱发回变菌落数与相应的空白对照组的平均每皿自发回变菌落数的比值（MR），如MR大于2为阳性，小于2为阴性。第2次试验剂量为0.2，1，5，25，100μg／皿，同时设同类药物对照（喹乙醇25μg／皿），其余与第1次试验相同。两次试验结果基本一致，TA97和TA100加和不加S9在剂量≥5μg／皿时均为阳性；TA98不加S9在剂量≥10μg／皿时为阳性，加S9在剂量≥5μg／皿时为阳性；TA102加和不加S9在剂量≥100μg／皿时均为阳性。阳性反应呈现一定的剂量反应关系。喹赛多100μg／皿对TA97有轻微抑菌作用，250μg／皿对TA97，TA98，TA100均有不同程度的抑菌作用。喹乙醇25μg／皿除TA102不加S9为阴性（MR=1.73）外，其余均为阳性。在本试验条件下喹赛多Ames试验结果为阳性。喹乙醇在TA102上的诱变性高于喹赛多。小鼠骨髓细胞微核试验第1次试验，取70只昆明种小鼠随机分为7组，雌雄各半，分别为空白对照组（蒸馏水），溶剂对照组（0.5％CMC），喹赛多组（0.016，0.16，1.6，16g／kg b.w．），阳性对照组（环磷酰胺（CP）40mg／kg b.w.）。第2次试验，取80只昆明种小鼠随机分为8组，雌雄各半，分别为溶剂对照组（0.5％CMC），喹赛多组（0.5，1，5，10，20g／kg b.w.），喹乙醇组（0.5g／kg b.w.），阳性对照组（CP 40mg／kgb.w.）。除阳性对照组外，其余各组均为每天灌胃给药1次，连续4d，第5d取胸骨骨髓制片。阳性对照组为腹腔注射给药2次，间隔24h，于末次给药后6h采样。每只小鼠计数1000个多染红细胞，计算含微核的嗜多染红细胞（MNPCE）数和含微核多染红细胞率，同时计数多染红细胞（PCE）和正染红细胞（NCE）的比例。两次试验结果均表明，溶剂对照组和喹赛多各剂量组含微核多染红细胞率与阴性对照组比较差异不显著（P＞0.05）。阳性对照组和喹乙醇组微核率与阴性对照组比较差异显著（P＜0.01）。各组小鼠的PCE／NCE均＞0.1，表明喹赛多对小鼠骨髓未呈明显的细胞毒性作用，红细胞的形成未受到抑制，不影响微核计数。阴性对照组含微核多染红细胞率＜3‰，符合一般自发率。喹赛多微核试验结果为阴性。喹乙醇的诱变性明显高于喹赛多。小鼠睾丸生殖细胞染色体畸变试验第1次试验取45只雄性昆明种小鼠随机分为9组，分别为阴性对照组（蒸馏水），溶剂对照组（0.5％CMC），喹赛多组（0.016，0.16，1.6，16g／kg b.w.），喹乙醇组（0.16，1.6g／kg b.w.），阳性对照组（CP 40mg／kg b.w.）。除阳性对照组为腹腔注射给药外，其余各组均为灌胃给药，每天1次，连续5d，于第11，12d再连续给药2d，第13d杀鼠。第1次试验给药5d后，1.6g／kg b.w.喹乙醇组小鼠在6d内陆续死亡。表明喹乙醇的毒性较强。第2次试验取45只雄性昆明种小鼠随机分为8组，分别为溶剂对照组（0.5％CMC），喹赛多组（0.5，1，5，10，20g／kg b.w.），喹乙醇组（0.5g／kg b.w.），阳性对照组（CP 40mg／kg b.w.）。给药方法和取样时间等与第1次试验相同。每只小鼠计数100个初级精母细胞中期相，进行染色体畸变分析。观察的染色体畸变的类型有断裂与断片、易位、性染色体早熟分离和常染色体早熟分离，并计算畸变细胞总数。两次试验结果均表明，除阳性对照组的断裂与断片（P＜0.01），畸变细胞总数（P＜0.01），阳性对照组的易位（P＜0.05）和喹乙醇组的畸变细胞总数（P＜0.05）与阴性对照组比较差异显著外，溶剂对照组和喹赛多组的各项指标与阴性对照组比较差异均不显著（P＞0.05）。喹赛多对小鼠睾丸生殖细胞无致突变作用，喹乙醇的致突变性高于喹赛多。3 90d喂养试验动物和分组SPF级Wistar大鼠雌性175只，雄性125只。随机分为5组，每组雌性35只，雄性25只。设喹赛多试验组，剂量为50、150、2500mg／kg饲料；药物对照喹乙醇组，剂量为150mg／kg饲料；空白对照组，饲以不添加药物的饲料。雌雄分笼饲养。各组均连续饲喂90d。观察项目和指标每周称量动物体重和饲料，计算平均摄食量、增重和饲料利用率。分别于用药后30d，60d，90d各组随机抽取10只大鼠，雌雄各半，取全血作血常规检验，血清作生化指标检验。并进行病理剖检和病理组织学检查，主要脏器称重，计算脏器系数。结果喹赛多最高剂量组大鼠粪便呈淡黄色，可能是药物（黄色）经粪便排出所致。给药2周后开始直至实验结束，喹赛多2500mg／kg饲料组大鼠体重显著低于空白对照组，喹乙醇组雌性大鼠在给药的第3周和第4周体重显著低于空白对照组。其他组与空白对照组比较差异不显著。各期杀鼠病理组织学观察表明喹赛多剂量为2500mg／kg饲料可引起大鼠肝细胞和肾脏近曲小管上皮细胞肿胀、变性。喹乙醇150mg／kg饲料组也出现相近的结果。结论喹赛多对Wistar大鼠亚慢性毒作用的靶器官为肝脏和肾脏，与喹乙醇相同。高剂量喹赛多引起的肝脏和肾脏病变为首次发现。喹赛多亚慢性无不良作用剂量（NOAEL）为150mg／kg饲料。相当于15mg／kg b.w.，这与本实验室进行的喹赛多大鼠长期毒性试验的结果基本一致。4两代喂养繁殖与致畸试验方法90d喂养试验除用于剖杀检查的大鼠之外，每组剩余的雌性20只，雄性10只，在90d喂养试验之后，进行交配。1／2孕鼠于妊娠20d剖腹进行畸胎检查，另1／2自然分娩，产生F1a。F1a断奶后处死，进行系统病理剖检。母鼠再次交配产生F1b。F1b断奶后处死F0，进行病理剖检并取其生殖器官进行病理组织学检查。F1b各组分别选留雌性28只，雄性15只，分别饲喂与亲代相同的饲料。饲喂30d时每组随机抽取雌雄各5只，扑杀，进行血常规、血清生化指标测定，计算脏体比，并进行系统病理剖检。余下F1b大鼠饲喂90d后进行交配，1／2孕鼠用于畸胎检查，另1／2自然分娩，产生F2a。F2a断奶后处死全部大鼠，进行系统病理剖检。畸胎检查包括测窝重、胎盘重、子宫重、黄体数、活胎数、死胎数、胎鼠体重、体长、尾长、性别，检查外观畸形，制作骨骼标本和内脏标本进行骨骼和内脏畸形检查。对所有子鼠在出生时检查外观畸形、体重、体长、尾长、活胎数、死胎数和性别比率等。出生4d时每窝随机选留8只，尽量雌雄各半，称5d重和21d重。F0和F1b在13周喂养期内每周称体重和饲料，计算平均摄食量、增重和饲料利用率。对亲代的影响喹赛多对孕鼠的健康状况，行为无明显不良影响，病理剖检未见明显的病变。组织病理学检查未见大鼠生殖器官受到损伤。体重：喹赛多2500mg／kg饲料组：雌雄F0体重在13周的喂养期内均自第3周开始显著低于空白对照组；雌性F1b在断奶后第2，5，11周显著低于空白对照组；雄F1b在断奶后第1，2，4周显著低于空白对照组，在第8周显著高于空白对照组。其他各剂量组大鼠体重没有受到试药的明显影响。饲料利用率：与空白对照组比较，雄性F0各剂量组均有所提高，雌性F0各组无显著差异；F1b各剂量组未出现明显的变化趋势。喹赛多2500mg／kg饲料组第2代致畸试验孕鼠体重显著低于空白对照组。病理组织学检查：F1b喂养30d扑杀病理组织学观察表明喹赛多剂量为2500mg／kg饲料时引起大鼠肝细胞和肾近曲小管上皮细胞肿胀、变性。喹乙醇150mg／kg饲料组也出现相近的结果。其他组未发现与试药相关的变化。对子代的影响喹赛多2500mg／kg饲料组：第1代致畸试验胎鼠体重、体长、尾长和窝重显著低于空白对照组，吸收胎数显著高于空白对照组；第2代致畸试验窝重和活胎数显著低于空白对照组，吸收胎数显著高于空白对照组：F1a，F1b和F2a出生活胎数显著低于空白对照组；F2a出生后21d体重显著低于空白对照组。喹赛多150mg／kg饲料组：F1b出生后5d体重和21d体重显著高于空白对照组。喹赛多50mg／kg饲料组：F1b出生后21d体重显著高于空白对照组。各组均未出现明显的与药物相关的外观和内脏畸形。喹赛多2500mg／kg饲料组F2a多肋变异显著增加；喹乙醇150mg／kg饲料组F2a多肋变异也明显增加，但差异不显著。除此之外未发现明显的骨骼畸形。结论喹赛多在剂量为2500mg／kg饲料（临床剂量的50倍）时对大鼠胚胎发育有轻度抑制作用，对大鼠的生长发育和生殖机能有轻度抑制作用，无明显的繁殖毒性和致畸性。喹赛多的安全性较高。并初步判定同等剂量下喹乙醇对大鼠生殖发育的不良影响高于喹赛多。喹赛多对大鼠生殖发育毒性的NOAEL为150mg／kg饲料，相当于15mg／kg b.w.。5预测致癌性和计算每日容许摄入量（ADI）及安全浓度根据3项致突变试验的结果，运用致癌性预测和试验组合的选择（CPBS）法计算受试物的潜在致癌性概率。喹赛多可能是潜在致癌物的概率为16％，喹乙醇可能是潜在致癌物的概率为100％。根据目前通用的判别标准，θ+＜30％判为非致癌物；30％＜θ+＜70％，暂时无法下结论：θ+＞70％，判为潜在致癌物。喹赛多可预测为非致癌物。喹乙醇可预测为致癌物。根据上述各试验结果得到喹赛多的NOAEL=15mg／kg b.w.，按照FDA的ADI和安全浓度计算公式，计算其ADI=0.15mg／kg b.w.；在肌肉的安全浓度为30μg／g；在肝脏的安全浓度为90μg／g；在肾脏和脂肪的安全浓度为180μg／g。实际给药时动物组织中原药及代谢物的残留量远远低于安全浓度。所以，喹赛多的安全性很高。上述试验基本按照我国农业部颁布的《新兽药一般毒性试验技术要求》和《新兽药特殊毒性试验技术要求》进行试验设计，并参照兽药注册国际协调局（VICH）的新兽药安全性评价要求，食品安全性毒理学评价程序，动物毒理学试验方法和卫生毒理学试验方法等相应指南和试验技术要求进行规范和完善。在国内外首次对喹赛多的急性毒性、亚慢性毒性、致突变性、致畸性、繁殖毒性进行了系统评价，并与同类药物喹乙醇进行比较。试验结果与相关研究基本一致，喹赛多的毒性很低，且明显弱于喹乙醇，潜在致癌性预测结果为非致癌物。且其安全浓度远远高于实际给药时动物组织中的残留量。具有较好的安全性。可为喹赛多的临床使用提供相关的科学依据，也为喹赛多作为新兽药审评提供相关的资料。

全文目录


摘要  7-12
ABSTRACT  12-18
缩略语表  18-20
1 前言  20-28
  1.1 毒理学研究在药物安全性评价和新药研发中的作用  20
  1.2 喹喔啉类药物毒理学研究概况  20-25
    1.2.1 一般毒性  21-22
    1.2.2 遗传毒性  22-23
    1.2.3 生殖毒性  23-24
    1.2.4 光敏毒性和光过敏症  24
    1.2.5 致癌性  24-25
  1.3 喹赛多研究进展  25
  1.4 研究内容和目标  25-28
    1.4.1 急性毒性试验  26
    1.4.2 致突变试验  26-27
    1.4.3 90d喂养试验  27
    1.4.4 喂养繁殖与致畸试验  27
    1.4.5 临床前安全性评价  27-28
2 喹赛多急性毒性研究  28-31
  2.1 材料方法  28-29
  2.2 结果  29-30
  2.3 讨论  30-31
3 喹赛多遗传毒性研究  31-48
  3.1 材料方法  32-38
    3.1.1 试药  32
    3.1.2 主要试剂  32
    3.1.3 仪器设备  32
    3.1.4 菌株  32
    3.1.5 试验动物  32
    3.1.6 试验方法  32-38
  3.2 结果  38-46
    3.2.1 大鼠肝S_9的制备  38
    3.2.2 Ames试验  38-43
    3.2.3 小鼠骨髓细胞微核试验  43-44
    3.2.4 小鼠睾丸生殖细胞染色体畸变试验  44-46
  3.3 讨论  46-48
4 90d喂养试验  48-65
  4.1 材料方法  48-51
    4.1.1 试药和主要仪器设备  48-49
    4.1.2 试验动物  49
    4.1.3 剂量分组与加药饲料的制备  49-50
    4.1.4 试验方法  50-51
  4.2 结果  51-63
    4.2.1 一般状况  51-52
    4.2.2 体重  52-54
    4.2.3 增重  54-55
    4.2.4 摄食量  55-56
    4.2.5 饲料利用率  56-61
    4.2.6 血常规和血清生化结果  61
    4.2.7 脏器系数结果  61
    4.2.8 病理学检查  61-63
  4.3 讨论  63-64
  4.4 结论  64-65
5 两代喂养繁殖与致畸试验  65-91
  5.1 材料方法  65-68
    5.1.1 试药和主要试剂  65
    5.1.2 主要仪器设备  65-66
    5.1.3 试验动物及其饲养管理  66
    5.1.4 试验方法  66-68
  5.2 结果  68-89
    5.2.1 一般状况  68
    5.2.2 交配前体重、增重、摄食量和饲料利用率  68-80
    5.2.3 致畸试验各项指标  80-84
    5.2.4 繁殖试验各项指标  84-89
  5.3 讨论  89-90
  5.4 结论  90-91
6 喹赛多临床前安全性评价  91-97
  6.1 评价方法  91-93
    6.1.1 CPBS法预测潜在致癌性概率  91-92
    6.1.2 计算ADI和安全浓度  92-93
  6.2 评价结果  93-95
    6.2.1 CPBS法预测潜在致癌性概率  93-94
    6.2.2 计算 ADI和安全浓度  94-95
  6.3 讨论  95-96
  6.4 结论  96-97
7 全文总结  97-99
8 文献综述(食品动物用药毒理学研究要求)  99-120
参考文献  120-130
致谢  130-131
附录  131-154

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医药物学
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