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两株生防链霉菌的发酵条件优化及发酵液理化性质的研究

作　者: 丁雪
导　师: 黄丽丽
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理
关键词: 淡紫灰链霉菌发酵条件优化正交试验理化性质
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

链霉菌是一种来源于土壤的丝状革兰氏阳性菌,迄今己约有几百个种。很多链霉菌都能产生对人类具有重要意义的天然代谢物,目前的多种抗生素中有一半来源于链霉菌,它产生多种次生代谢物质,在植物保护方面也发挥了巨大作用。链霉菌产生的农用抗生素种类多,而且大多己在农业生产中广泛应用,可防治真菌、细菌、线虫病害及一些重要的害虫,有的还具有除草活性。本研究采用杯碟法,以猕猴桃溃疡菌和枯草芽孢杆菌为指示菌,对菌株Xjy和gCLA4的培养基、摇床发酵条件进行优化,最后探索了gCLA4菌株的发酵液理化性质以及两株菌产胞外酶的情况。本研究首先进行了菌株Xjy发酵培养基的优化。考察了碳源、氮源、无机盐对发酵的影响,然后在单因素试验的基础上进行了正交试验的优化。确定的培养基配方为:麸皮2%、豆粕1%、NaCl 1.5%、CaCO30.6%、（NH4）2SO41%、K2HPO40.04%、FeSO40.001%。以此成本相对较低的培养基发酵,抑菌圈直径比原发酵培养基提高了36%。在优化培养基的基础上对该菌的培养条件也进行摸索,得到了如下结果:最适温度为20-35℃、摇床转速为150 rpm、初始pH值为5.5-8.0、装料量为50 ml/250 ml。针对新的培养基配方进行了摇瓶代谢情况的测定,结果表明在72 h时菌体含量达到最高,对糖和氮的消耗也达到最大;pH值也增大到高峰值,活性物质的产生在60h时达到高峰。所以可以把发酵时间由此前的120 h缩短到60 h以内。这样会大大缩短发酵周期,降低发酵的成本。通过单因素试验和正交试验得到了菌株gCLA4的最适培养基配方:砂糖1.5%、麸皮1.5%、NH₄NO₃ 1.5 %、NaCl0.4%、CaCO3 0.2%、K2HPO40.05%。最适的摇瓶培养条件:初始pH值6.5,装液量40mL/250mL,温度30℃,转速150rpm。菌株gCLA4摇瓶代谢状况表明:生物量在48-60h时达到高峰,发酵液中的还原糖含量水平一直比较低,随着发酵的进行还原糖越来越少,到后期含量很微弱。总糖和氨基氮也是逐渐减少,在48h左右菌体大量生长的阶段,二者的含量急剧下降。此后总糖含量一直在降低,而氨基氮的水平开始回升并保持稳定的含量, pH值在整个发酵过程中变化不大,开始有小的下降后逐步增大到7.96,然后逐渐降低到7.71。发酵液在36h左右开始产生抑菌物质,到96h时活性物质含量达到最高。所以在当前的培养条件下可以把发酵周期提前到96 h。对菌株gCLA4产生的活性物质理化性质研究结果表明,该活性物质对紫外线和自然光照射稳定,对90℃以下的高温相对稳定,不耐120℃左右的高温,对酸性和中性的pH比较稳定,遗传稳定性试验表明该菌在传代过程中有一定的退化。通过通过胶体几丁质平板、茯苓（苯胺蓝）平板和蛋白酶筛选培养基的产酶筛选试验发现,菌株xjy和gCLA4均能产生蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶,而不能产生几丁质酶。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章文献综述  12-24
  1.1 生物防治的意义及其应用  12-14
    1.1.1 生物防治的概念  12
    1.1.2 生物防治的机制  12-14
  1.2 微生物农药  14-18
    1.2.1 微生物农药研究现状  14-17
    1.2.2 微生物在生物防治应用中存在的问题  17-18
  1.3 链霉菌及其代谢产物植物保护上的应用  18-19
    1.3.1 链霉菌概述  18
    1.3.2 链霉菌及其抗生素在植物保护上的作用  18-19
  1.4 微生物发酵  19-22
    1.4.1 发酵条件的优化  19-20
    1.4.2 微生物发酵工艺优化方法的研究  20-22
  1.5 本试验的研究的目的意义  22-23
  1.6 立题依据  23-24
第二章材料和方法  24-30
  2.1 菌种  24
    2.1.1 靶标菌种  24
    2.1.2 供试生防放线菌  24
  2.2 主要仪器  24
  2.3 主要试剂的配置  24-25
  2.4 培养基  25
    2.4.1 菌种保藏培养基  25
    2.4.2 初始发酵培养基  25
    2.4.3 种子培养基  25
    2.4.4 生防菌产酶检测培养基  25
  2.5 培养方法  25-26
    2.5.1 菌种培养  25-26
    2.5.2 种子培养  26
    2.5.3 发酵培养  26
  2.6 分析方法  26-28
    2.6.1 发酵单位的测定方法  26
    2.6.2 菌体生物量的测定  26
    2.6.3 发酵液pH 值的测定  26
    2.6.4 糖的测定  26-27
    2.6.5 氨基氮的测定  27-28
  2.7 研究方法  28-30
    2.7.1 发酵培养基的改良  28
    2.7.2 发酵工艺的优化  28-29
    2.7.3 改良培养基下代谢情况  29
    2.7.4 gCLA4 发酵液理化性质的研究  29
    2.7.5 生防菌产酶情况分析  29-30
第三章试验结果  30-50
  3.1 菌株Xjy 的培养基优化  30-34
    3.1.1 碳源对发酵水平的影响  30
    3.1.2 氮源对发酵效价的影响  30-31
    3.1.3 无机盐的对发酵效价的影响  31-32
    3.1.4 正交试验  32-34
  3.2 菌株Xjy 的发酵条件优化  34-37
    3.2.1 温度对发酵效价的影响  34-35
    3.2.2 摇床转速对发酵效价的影响  35-36
    3.2.3 初始ph 值  36
    3.2.4 装料量  36-37
  3.3 菌Xjy 的摇瓶代谢情况  37-38
  3.4 菌株的gCLA4 的培养基优化  38-43
    3.4.1 碳源对发酵水平的影响  38
    3.4.2 不同氮源对发酵水平的影响  38-39
    3.4.3 硝酸铵和麸皮的最佳比例  39
    3.4.4 碳源浓度对发酵水平的影响  39-40
    3.4.5 不同氮源浓度对发酵水平的影响  40
    3.4.6 不同浓度的氯化钠对发酵水平的影响  40-41
    3.4.7 无机盐对发酵效价的影响  41
    3.4.8 正交试验  41-43
  3.5 菌株的gCLA4 的发酵条件研究  43-45
    3.5.1 温度对发酵水平的影响  43-44
    3.5.2 摇床转速对发酵水平的影响  44
    3.5.3 pH 值对发酵水平的影响  44-45
    3.5.4 装料量对发酵水平的影响  45
  3.6 gCLA4 的摇瓶代谢情况  45-46
  3.7 菌株的gCLA4 的发酵液理化性质研究  46-48
    3.7.1 对紫外光和自然光的稳定性测定  46-47
    3.7.2 热稳定性测定  47
    3.7.3 酸碱稳定性测定  47-48
    3.7.4 遗传稳定性测定  48
  3.8 生防菌产酶情况  48-50
第四章结论与讨论  50-52
  4.1 结论  50
  4.2 讨论  50-52
参考文献  52-56
致谢  56-57
个人简介  57-58
实验附图  58-59

两株生防链霉菌的发酵条件优化及发酵液理化性质的研究

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