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白腐菌1j-1漆酶性质与功能的初步研究

作　者: 李夏
导　师: 黄峰
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 木质素漆酶响应面分析微波
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

我们本着提高木质素降解效率的目的,经过野外采集、分离纯化,筛选到了一株具有良好特性的白腐菌。该菌株生长迅速,而且纯化得到的漆酶表现出许多比其他普通漆酶应用前景更好的特征,如热稳定性高,同时最适pH值低,因此具有一定的理论研究价值。经过形态学及子实体形态观察,然后查阅《真菌鉴定手册》,初步将该菌株鉴定为Trametes sp.lj-1。我们通过其生物量及产酶曲线的研究,掌握了其生长规律,再经过正交试验、部分因子试验、最陡爬坡以及响应面分析等方法对影响lj-1产漆酶的因素进行了分析,结果表明C/N比在漆酶的发酵生产中有很大影响。优化的最佳碳源和氮源的值分别为C：10.45gl-,N：1.28gl-1,最大产酶量是33.48 U ml-1,优化结果说明lj-1产漆酶发酵时需要较低的氮源,因此可在实际应用中指导性的在发酵过程中少添加氮源,从而有效的降低发酵成本。在此结果之上,我们用传统方法对该漆酶进行了分离纯化和其性质研究的工作。经过粗酶液的制备与纯化,我们得到了电泳纯的漆酶,同时SDS-page电泳结果表明该漆酶的分子量大约为60kDa；全波段紫外扫描发现该漆酶在600nm处T1铜离子的吸收峰,说明属于普通漆酶：对于底物ABTS最适反应pH值为3.0,对于底物2,6-DMP最适反应pH值是2.6,但是在最适pH时漆酶不稳定,而该漆酶与两种底物进行反应时在pH为4.5时均非常稳定；综合活性与稳定性的综合考虑,将该漆酶的最适反应温度定为40℃,而且在最适反应温度的时候及其稳定,保温24小时后酶活性丧失可以忽略不计。最后我们结合微波外场作用,用纯化好的漆酶对酶分离木质素(CEL)进行处理,研究了处理前后木质素中酚羟基含量的变化,并进行紫外、红外光谱分析,希望阐明漆酶的作用机理。研究发现,在该漆酶的最适反应温度时,微波辐射基本不会造成该酶酶活的降低。同时,通过与无微波辐射的对照实验相比,发现微波辐射能够在较短的时间内引起CEL中酚羟基的增加,这有利于CEL的降解,紫外、红外光谱也证明了这一结论。微波辐射在CEL的降解作用中能够起到一个积极的作用,分析其原因可能与微波全方位、立体式的加热方式有关,也有研究者提出木质素的降解可能存在由非酚型底物转变成酚型底物的过程,再由酚型氧化酶进行氧化降解这一假说,本实验可以为这一假设提供证明。

全文目录

目录  4-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
符号说明及缩写词  11-12
第一章绪论  12-34
  1.1 木质素降解的意义  13
  1.2 生物质中的木质素  13-20
    1.2.1 木质素的分布  13-15
    1.2.2 木质素的结构  15-18
    1.2.3 木质素的化学性质  18
    1.2.4 木质素的降解因素  18-20
  1.3 漆酶  20-29
    1.3.1 漆酶的结构及生理功能  21-26
      1.3.1.1 T_1铜离子结合位点  22-23
      1.3.1.2 T_2/T_3铜离子结合位点  23-25
      1.3.1.3 三铜中心  25
      1.3.1.4 漆酶生理功能  25-26
    1.3.2 漆酶的反应机制  26-28
    1.3.3 漆酶的应用  28-29
  1.4 微波在生物质降解中的应用  29-32
  1.5 本文的立题依据及研究内容  32-34
第二章菌株的筛选及其漆酶发酵条件的优化  34-48
  2.1 材料与方法  34-38
    2.1.1 实验所用菌株  34
    2.1.2 培养基  34-35
    2.1.3 菌种的筛选  35
    2.1.4 粗酶液中漆酶酶活性测定  35-36
    2.1.5 所得菌株产漆酶能力比较  36
    2.1.6 形态观察  36
    2.1.7 菌丝体形态  36
    2.1.8 生物量及产漆酶时间曲线  36-37
    2.1.9 正交试验筛选影响漆酶产量的关键因素  37
    2.1.10 部分因子试验  37
    2.1.11 最陡爬坡试验  37-38
    2.1.12 响应面分析试验  38
  2.2 实验结果和分析  38-47
    2.2.1 产漆酶菌株的筛选  38-39
    2.2.2 形态学鉴定  39
    2.2.3 生物量和产酶时间曲线的测定  39-40
    2.2.4 正交试验  40-42
    2.2.5 部分因子试验  42-43
    2.2.6 最陡爬坡试验  43
    2.2.7 响应面分析试验  43-47
  2.3 本章小结  47-48
第三章 lj-1漆酶的纯化和酶学性质测定  48-59
  3.1 材料与方法  48-53
    3.1.1 菌株与培养方法  48
    3.1.2 漆酶分离纯化的实验流程图  48-51
      3.1.2.1 漆酶的发酵培养  49
      3.1.2.2 漆酶活性的测定  49
      3.1.2.3 粗酶液制备  49
      3.1.2.4 超滤浓缩  49
      3.1.2.5 硫酸铵分级沉淀  49-50
      3.1.2.6 透析  50
      3.1.2.7 DEAE-Sepharose FF离子交换层析  50
      3.1.2.8 蛋白质含量的测定  50-51
    3.1.3 漆酶酶学性质的研究  51-53
      3.1.3.1 漆酶的SDS-PAGE电泳  51
      3.1.3.2 漆酶的全波段光谱吸收  51-52
      3.1.3.3 酶促反应动力学研究  52
      3.1.3.4 温度对漆酶活性的影响  52
      3.1.3.5 pH值对漆酶活性的影响  52
      3.1.3.6 温度对漆酶稳定性的影响  52
      3.1.3.7 pH值对漆酶稳定性的影响  52
      3.1.3.8 漆酶抑制剂的研究  52-53
  3.2 结果与讨论  53-57
    3.2.1 漆酶的分离纯化  53-54
      3.2.1.1 DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析  53-54
      3.2.1.2 漆酶分离纯化的过程总结  54
    3.2.2 lj-1漆酶酶学性质的研究  54-57
      3.2.2.1 SDS-PAGE电泳  54-55
      3.2.2.2 全波段光谱吸收  55
      3.2.2.3 酶促反应动力学研究  55
      3.2.2.4 最适反应温度  55-56
      3.2.2.5 最适pH  56-57
      3.2.2.6 漆酶抑制剂的研究  57
  3.3 本章小结  57-59
第四章 lj-1漆酶在微波外场条件下对木质素降解的初步研究  59-68
  4.1 材料与方法  60-62
    4.1.1 实验材料  60
    4.1.2 实验方法  60-62
      4.1.2.1 漆酶酶活测定  60
      4.1.2.2 酶分离木质素的提取  60-61
      4.1.2.3 微波辐射对漆酶活性的影响  61
      4.1.2.4 微波辐射条件下漆酶与木质素反应  61-62
      4.1.2.5 酚羟基含量的测定  62
      4.1.2.6 紫外光谱分析  62
      4.1.2.7 红外光谱分析  62
  4.2 结果与讨论  62-66
    4.2.1 酶分离木质素(CEL)的提取和纯化  62-63
    4.2.2 最适温度下微波辐射对漆酶活性的影响  63
    4.2.3 酚羟基含量变化  63-64
    4.2.4 紫外光谱分析  64-65
    4.2.4 红外光谱分析  65-66
  4.3 本章小结  66-68
全文总结及展望  68-70
参考文献  70-79
致谢  79

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