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内容摘要

病虫害是世界农作物生产的重要危害之一。为了预防病虫害对农业造成的重大损失,目前多运用农药进行防治,虽然农药在一定程度上能够控制病虫害,但是由于长期大量施用农药使一些害虫产生了抗性,而且还造成了对环境的污染,对人类的生存环境和身体健康都构成了威胁等问题。因此人们一直在追求更有效的,更环保的,可持续发展的方法来控制病虫害。植物基因工程的发展为病虫害的预防提供了新的思路。在过去的二十多年里,人们已经发现几个来源于植物和微生物的抗虫基因并将其转入植物中用以控制害虫。目前的研究大多在苏云金杆菌毒蛋白和植物蛋白抑制剂等抗虫基因上,其中苏云金杆菌毒蛋白是被研究得较多并应用较广泛的一个抗虫基因,它主要对咀嚼类害虫如鳞翅类和鞘翅类有较好的抗性。植物蛋白抑制剂基本上是对鳞翅目类害虫有毒害作用。而对其他类型的害虫如同翅目的有毒害作用的抗虫基因鲜有报道,所以寻找和研究这类抗虫基因对病虫害的防治研究具有重要的意义。本研究将蜡梅凝集素基因Cplectin导入模式植物烟草中,得到转基因烟草,对转基因烟草进行抗虫性试验。同时构建原核表达载体,将原核表达载体转入大肠杆菌中让其表达重组蛋白。其研究结果如下:1通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经过K_M~+抗性生根的检测,组织化学GUS染色,PCR检测,得到了转基因植株。2转基因烟草进行抗虫实验结果。1)转基因与未转基因烟草植株各17棵在蛞蝓活动的高峰期进行抗虫初步调查,初步的抗虫实验结果表明:对照植株被蛞蝓危害严重,转基因的植株表现出明显的抗蛞蝓能力,只受蛞蝓轻微的危害,转基因与未转基因的虫害指数分别0.10和0.75。2)在大田蚜虫实验中,将转基因烟草与未转基因烟草放于温室中种植,让其自然感蚜,观察转基因与未转基因的抗性效果,结果表明转基因烟草都表现出对蚜虫的良好抗性。3)对转基因植株和叶片进行抗蚜性实验也表明:转基因植株在一定程度上抑制蚜虫的生长密度。转基因离体叶片的蚜虫实验的平均抑制率为68%,转基因幼苗蚜虫实验的平均蚜虫抑制率为60%。说明了Cplectin基因在烟草中得到了表达并且表现出对蚜虫具有一定的抑制作用。3构建原核表达载体采用PCR技术将目的基因克隆出来,与PMD18-T载体相连,经测序无误之后,将含有Cplectin基因的PMD18-T载体和PET-28a用NcoⅠ和XhoⅠ酶切,分别回收基因片段和线性载体并连接。对重组质粒进行PCR检测和酶切鉴定,说明了含有Cplectin基因的原核表达载体构建成功。4.重组质粒pET-28a-Cplectin在大肠杆菌中的表达将重组质粒pET-28a-Cplectin转入大肠杆菌BL21中进行培养,用终浓度为1 mmol/LIPTG诱导蛋白的表达,经SDS-PAGE检测重组蛋白说明了Cplectin在E.coli中得到了表达。

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摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
第1章文献综述  9-20
  1.1 BT基因及其应用  9-10
  1.2 蛋白酶抑制剂基因  10-11
  1.3 植物外源凝集素基因  11-18
  1.4 存在的问题及研究现状  18-20
第2章引言  20-21
第3章蜡梅凝集素基因在烟草中抗蚜性分析  21-37
  3.1 技术路线  21
  3.2 试验材料  21-23
  3.3 试验方法  23-27
  3.4 结果与分析  27-35
  3.5 讨论  35-37
第4章蜡梅凝集素基因的原核表达  37-52
  4.1 技术路线  37
  4.2 试验材料与试剂  37-39
  4.3 试验方法  39-45
  4.4 结果与分析  45-50
  4.5 讨论  50-52
第5章总结  52-53
  5.1 主要结论  52
  5.2 进一步研究设想  52-53
参考文献  53-57
缩略词表  57-58
致谢  58-59
发表的论文及参加的课题  59

蜡梅（Chimonanthus praecox （L.）Link）凝集素基因Cplectin的抗虫功能分析

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