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利用猪牛胸腺提取胸腺肽工艺技术的研究

作　者: 刘茗飞
导　师: 张丽萍
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 食品科学
关键词: 胸腺肽胸腺肽α1 提取率超声波法反复冻融法
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

胸腺肽是胸腺直接分泌的多肽类激素,主要用于治疗自身免疫缺陷疾病以及抑制肿瘤放化疗引起的白血球减少等症。现今市场上所销售的胸腺肽大多是从幼牛胸腺或猪胸腺肽中提取,幼牛胸腺供应量十分不足,导致产品价格居高不下,目前国内外采用的提取方法多数是沿袭Goldstein研究的提取方法,但其纯化步骤繁琐,得到终产物在含量和活性上都存在一定缺陷,国内市场上所销售的胸腺肽中胸腺肽α₁含量很低（一般在1%以下）,导致纯度和活性较低、临床疗效差。鉴于以上几种情况,实验力求筛选出一条高效低成本、纯度高、活力强的制备工艺路线。针对以上状况作如下研究:（1）超声波法提取胸腺肽工艺研究及其技术参数的优化。通过胸腺肽提取工艺方法的研究,确定出高效、低成本的提取工艺技术。以牛胸腺、猪胸腺为原料,采用反复冻融法测定胸腺肽的含量;通过复合旋转实验,确定提取胸腺肽的最佳工艺参数;通过对中性盐的盐析实验,选择盐析方法。研究结果表明:牛胸腺中胸腺肽含量较高(2.0968mg·g^-1);超声波法提取胸腺肽最佳工艺参数为:浸提液为0.15M NaCl溶液,浸提液液料比为8﹕1,浸提液pH值为4.12±0.01,超声波输出功率320W,超声波处理时间14min,离心转速为8300rpm;硫酸铵在30%～65%饱和度时分离胸腺肽效果最佳;验证实验胸腺肽的提取率可达到4.3961mg·g^-1,较国内平均提取率3 mg·g^-1有明显提高,从成本上每千克节省3000～8000元。（2）超声波法与常规法提取胸腺肽效果的比较分析。通过对超声波法与反复冻融法这两种方法在活性、提取率及提取效率上的比较,确定超声波法的可行性。采用E-玫瑰花环节法测定胸腺肽的生物活性,福林酚法测定胸腺肽的含量,并确定含量与活性之间的相关性。实验结果表明,超声波法与反复冻融法比较,经T-Test分析,超声波法在提取率方面显著提高（α为0.01）,生物活性方面相当,其中超声波法制备的胸腺肽花环结增加值均高于17%,符合国家对药厂出厂的规定（10%）,提取效率方面,超声波法节省近200倍时间,超声波法制备的胸腺肽其活性与含量呈不完全正相关关系,r为0.8304,二者之间的回归方程为:Y∧=9. 5393+1.1399X,以上各方面说明,超声波法与反复冻融法相比,提取效率高,工艺过程简单。（3）胸腺肽α₁分离纯化工艺研究及其技术参数的优化。通过对胸腺肽α₁的分离纯化,提高胸腺肽α₁的纯度,确定简单可行的纯化工艺技术。将QAE Sephadex A-25和D208、D301、717等阴离子交换介质进行静态吸附实验,确定最适离子交换介质;对洗脱液及洗脱方式、流速、填料高度的最佳实验条件进行摸索,选择L9（33）正交实验对流速、填料高度及进样浓度这三个因素进行优化,确定最佳分离条件;采用Sephadex G-25凝胶过滤色谱对纯化的胸腺肽α₁脱盐;选用HPLC和SDS-PAGE对纯化的胸腺肽α₁进行鉴定。结果表明,将QAE Sephadex A-25作为填料介质吸附胸腺肽α₁效果最好,在流速60cm·h^-1,填料高度50cm,进样浓度8mg·mL^-1时,胸腺肽α₁纯化效果理想,经HPLC测定,得到纯度达24.5966mg·mL^-1的胸腺肽α₁,回收率达9.7%,质量分数达12.03%,较之市场上所销售的胸腺肽中Tα₁含量（质量分数0.6%～1%）高出近10倍。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
缩略词  8-9
第一章引言  9-17
  1.1 胸腺肽的性质、组成及功能  9-12
    1.1.1 胸腺肽的性质  9
    1.1.2 胸腺肽的主要成分及功能  9-12
  1.2 胸腺肽提取分离纯化技术的国内外研究现状  12-14
    1.2.1 胸腺肽粗提取工艺技术的发展与现状  12-13
    1.2.2 胸腺肽浓缩技术的发展现状  13-14
    1.2.3 胸腺肽纯化精制技术的发展现状  14
  1.3 课题的研究背景及意义  14-15
  1.4 研究内容  15-17
    1.4.1 超声波法提取胸腺肽的工艺研究及其技术参数优化  15-16
    1.4.2 超声波法与常规法提取胸腺肽效果的比较分析  16
    1.4.3 胸腺肽α_1 分离纯化工艺研究及其技术参数的优化  16-17
第二章超声波法提取胸腺肽的工艺研究及其技术参数优化  17-39
  2.1 实验材料  17-18
    2.1.1 原材料  17
    2.1.2 试剂  17-18
    2.1.3 仪器设备  18
  2.2 实验方法  18-20
    2.2.1 试剂的配制  18-19
    2.2.2 检测方法  19
    2.2.3 技术路线  19-20
    2.2.4 原料预处理  20
  2.3 实验内容与结果分析  20-37
    2.3.1 结晶牛血清白蛋白标准曲线的绘制  20-21
    2.3.2 猪牛胸腺中胸腺肽含量的测定与分析  21-22
    2.3.3 超声波法提取胸腺肽工艺条件优化的实验与分析  22-33
    2.3.4 胸腺肽粗液等电点的测定  33-34
    2.3.5 盐析分级沉淀分离实验与分析  34-36
    2.3.6 透析脱盐  36-37
    2.3.7 超滤  37
    2.3.8 真空冷冻干燥  37
  2.4 验证实验与成本分析  37
  2.5 本章小结  37-39
第三章超声波法与常规法提取胸腺肽效果的比较分析  39-48
  3.1 实验材料  39-40
    3.1.1 原材料  39
    3.1.2 试剂  39
    3.1.3 仪器设备  39-40
  3.2 实验方法  40-42
    3.2.1 试剂的配制  40
    3.2.2 检测方法  40-42
  3.3 实验内容与结果分析  42-46
    3.3.1 超声波法制备胸腺肽生物活性的测定与分析  42-44
    3.3.2 超声波法与常规提取法比较分析  44-45
    3.3.3 胸腺肽活性与含量的相关性分析  45-46
  3.4 本章小结  46-48
第四章胸腺肽Α_1分离纯化工艺研究及其技术参数的优化  48-70
  4.1 实验材料  48-49
    4.1.1 原材料  48
    4.1.2 仪器设备  48-49
    4.1.3 试剂  49
  4.2 实验方法  49-53
    4.2.1 试剂的配制  49-50
    4.2.2 检测方法  50-51
    4.2.3 技术路线  51-52
    4.2.4 胸腺肽粗品的制备  52
    4.2.5 等电点沉淀法制备胸腺肽α_1  52-53
  4.3 实验内容与结果分析  53-68
    4.3.1 阴离子交换色谱纯化胸腺肽α_1 实验与分析  53-63
    4.3.2 凝胶过滤色谱纯化胸腺肽α_1 实验与分析  63-64
    4.3.3 阴离子交换色谱纯化胸腺肽α_1 验证实验与结果分析  64-66
    4.3.4 SDS-PAGE 电泳检测与分析  66-68
    4.3.5 纯化效果的评价  68
  4.4 本章小结  68-70
第五章结论与建议  70-71
  5.1 结论  70
  5.2 建议  70-71
参考文献  71-76
致谢  76-77
作者简历  77

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