学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

不同序列型ail基因克隆菌株的构建及其粘附侵袭性分析

作　者: 吉芳坤
导　师: 段广才；景怀琦
学　校: 郑州大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 小肠结肠炎耶尔森菌 ail基因序列多态性粘附侵袭
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 11次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

小肠结肠炎耶尔森菌广泛分布于自然界,是能在冷藏温度下生长的少数肠道致病菌之一,主要经消化道传播,是一种重要的食源性致病菌,很多国家都已将其列为进出口食品的常规检测项目。小肠结肠炎耶尔森菌对人类和动物具有明显的致病性,感染后可表现为一系列不同症状,除能引起胃肠道症状外,还能引起呼吸系统、心血管系统、骨骼结缔组织等局部组织和全身的疾患,甚至可引起败血症,造成死亡。致病性细菌的共同特征就是突破宿主的防御机制,与细菌生存特征(细胞外生存或细胞内寄生)密切相关。致病性小肠结肠炎耶尔森菌是一种兼性细胞内致病菌,粘附侵袭性是其毒力机制的重要特征,介导粘附侵袭相关功能的ail基因被认为是其毒力机制的一个重要因素。目前可将国内外已获得的致病菌株的ail基因分为3种类型：高致病株(1b/0：8)来源的A2型；低致病株来源的A1型；新发现序列A3型。小肠结肠炎耶尔森菌的粘附侵袭机制非常复杂,是多种已知和未知因素综合作用的结果,一旦某种因素发生改变,就有可能引起其功能表型的相应改变,因而粘附侵袭位点基因(ail)的核酸序列出现改变时,就有可能会引起其粘附侵袭表型的改变。目的1.构建不同序列型ail基因的重组克隆菌株。2.利用体外组织细胞粘附侵袭实验探索ail基因序列多态性可能会引起的Ail蛋白功能的改变及其与不同生物血清型菌株间致病性差异的关系。3.初步分析代表新序列型ail基因的IE419菌株在粘附侵袭功能及细菌毒力方面是否出现改变。方法1.选择分别代表3种不同序列型ail基因的致病性耶尔森菌,通过PCR扩增获得基因序列后,构建pMD18-T-ail重组质粒,分别转入大肠杆菌JM109和非致病性小肠结肠炎耶尔森菌Y40。挑选克隆菌株进行特异性PCR和测序鉴定。2.用经鉴定正确连接的阳性克隆菌株,对HEp-2细胞和HT-29细胞做体外粘附侵袭实验。计算各个克隆菌株的粘附侵袭效率,筛选粘附侵袭表型阳性克隆菌株,并比较不同序列型克隆菌株在粘附侵袭功能上是否存在差异,尤其关注新发现A3序列型ail基因粘附侵袭功能的改变。结果1.经PCR扩增、测序鉴定,成功构建重组质粒pMD18-T-ail,转化得到重组菌株JM109/pMD18-T-ail和Y40/pMD18-T-ail。2. RT-PCR结果显示,不同序列型ail基因在各种克隆菌株中成功转录。3.体外粘附侵袭实验显示,对小鼠高致病株Ye92010(1b/O:8)代表的A2型大肠杆菌克隆菌株能够稳定表达粘附侵袭功能,而对小鼠低致病株HA8629(2/O:9)代表的A1型大肠杆菌克隆菌株和IE419(2/O:9)代表的新发现A3型大肠杆菌克隆菌株均只有1株显示粘附侵袭功能；3种类型大肠杆菌克隆菌株对两种组织细胞的粘附侵袭作用无系别差异。4.显微镜下观察3种粘附侵袭阳性的大肠杆菌克隆菌株与HEp-2细胞作用后的染色图片,结果显示：与致病性小肠结肠炎耶尔森菌相比,克隆菌株沿细胞排列的形态出现改变,呈点状、散在分布。5.3种类型非致病性小肠结肠炎耶尔森菌ail基因克隆菌株均不表现粘附侵袭的功能,并且在获得ail基因后,其本身固有的非特异性粘附效率出现了下降。结论1.成功构建不同序列型ail基因的大肠杆菌克隆菌株和非致病性小肠结肠炎耶尔森菌克隆菌株。2.通过体外粘附侵袭实验获得含不同序列型ail基因且粘附侵袭表型阳性的大肠杆菌克隆菌株。3.ail基因序列多态性对不同生物血清型致病性菌株的致病毒力可产生影响；非致病性小肠结肠炎耶尔森菌中ail基因的缺失有可能是其致病毒力缺失的原因之一。4.在本次研究中,A3型ail基因克隆菌株与A1型ail基因克隆菌株在粘附侵袭功能上不存在差异。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-14
引言  14-18
第一部分 ail基因克隆菌株的构建  18-35
  1 材料与方法  18-31
    1.1 实验材料  18-22
    1.2 实验方法  22-31
  2 结果  31-34
    2.1 致病性小肠结肠炎耶尔森菌ail基因的获取  31-32
    2.2 阳性克隆子的筛选鉴定  32-33
    2.3 RT-PCR  33-34
  3 小结  34-35
第二部分粘附侵袭实验  35-45
  1 材料与方法  35-40
    1.1 实验材料  35-37
    1.2 实验方法  37-40
  2 结果  40-44
    2.1 显微镜下细胞形态学特征  40-42
    2.2 粘附侵袭实验  42-44
  3 小结  44-45
讨论  45-50
结论  50-51
参考文献  51-55
综述耶尔森菌免疫学研究进展  55-67
  参考文献  63-67
个人简历在学期间发表的学术论文及研究成果  67-68
致谢  68-69

不同序列型ail基因克隆菌株的构建及其粘附侵袭性分析

内容摘要

全文目录

相似论文