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萝卜肉质直根形成膨大的生理生化、基因差异表达与甲基化变化研究

作　者: 王玮
导　师: 龚义勤；柳李旺
学　校: 南京农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 萝卜 肉质根 碳水化合物 蔗糖代谢酶 mRNA差异显示 DNA甲基化
分类号: S631.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


萝卜（Raphanus sativus L.）是世界范围内广泛栽培的蔬菜种类之一。其栽培历史悠久，营养丰富，在我国蔬菜生产中占有十分重要的地位。萝卜以其膨大的肉质直根作为主要的食用器官。然而在生产上长期存在的一些诸如空心、畸形根等问题严重影响了肉质根的产量和品质的提高。肉质根的膨大是一个复杂的生理生化过程，涉及到形态建成、营养物质积累和相关基因表达等一系列的问题。对其膨大过程中的相关生理生化、基因差异表达及DNA甲基化模式变化的研究将有助于我们从分子水平上阐明萝卜肉质直根膨大的机理，为萝卜的遗传改良和品质产量提高提供一定的理论依据。本文首先以根冠比差异显著的萝卜品系为材料研究了肉质直根膨大中的碳水化合物、蔗糖代谢相关酶的变化。结果表明，不同根冠比肉质根的库活性变化基本一致，“破肚”后一周内达到最大；可溶性总糖、果糖、蔗糖含量初期下降，“破肚”期降至最低值，其中低根冠比品系‘NAU-LR-04’蔗糖含量一直高于其它高根冠比品系，而其果糖含量则相对较低。肉质根中蔗糖合酶的活性变化与肉质根库活性的变化趋势基本一致，且低根冠比品系蔗糖合酶活性相对高于高根冠比品系，推测蔗糖合酶可能是调节肉质根蔗糖水平、控制肉质根库活性的关键酶。对‘NAU-LHZ-03’不同生育期的叶片及肉质根的同工酶电泳研究发现，肉质根中的SOD和EST的同工酶谱带无论是强度还是数量均明显多于叶片，不同生育期的叶片SOD同工酶较肉质根均缺少了一条迁移率0.15的条带，推测迁移率为0.15的肉质根特有的SOD同工酶谱带可能与萝卜肉质根的膨大性状相关。而α-淀粉酶在叶片和肉质根中只具有相同的两条谱带，且整个生育期均是如此，说明淀粉酶同工酶在萝卜叶片和根部组织的不同发育时期基本无差异性。以‘NAU-YH-05’为材料使用了60对引物组合对其肉质根进行mRNA差异显示的分析，发现不同生育期肉质根基因表达样式十分丰富。对部分差异条带进行了克隆测序，登陆GENEBANK对差异cDNA片断的序列进行核苷酸及氨基酸的同源性对比，其中一些片断与拟南芥CIPK7、拟南芥At3g23000基因、拟南芥SNF1相关蛋白激酶mRNA、栽培黄瓜RBL1mRNA全序列、毛茛核糖体蛋白L14基因、胡萝卜染色体基因组等均有86％-90％左右的同源性，还有部分片断的同源性很低，可能为未知基因序列。使用21对引物对根冠比差异较大的萝卜品系‘NAU-DY002’、‘NAU-LHZ-03’的叶片及肉质根进行DNA甲基化模式的分析，结果发现两个品种肉质根DNA甲基化程度均随生育期的延长而升高，但是低根冠比的‘NAU-LHZ-03’D1、D2期甲基化程度明显高于高根冠比的‘NAU-DY-02’的对应值，而其D3期的甲基化水平却又相对较低。对叶片和肉质根甲基化水平的检测都表明基因组DNA的全甲基化水平明显高于半甲基化的水平，说明不同部位不同时期的基因组DNA的甲基化均是以内侧胞嘧啶完全甲基化为主，而半甲基化率较低。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
引言  11-13
第一章 文献综述  13-33
  1 萝卜肉质根形成的细胞形态学基础  13-14
    1.1 肉质根形成过程  13-14
    1.2 决定肉质根膨大的组织  14
  2 影响肉质根形成的环境因素  14-16
    2.1 温度  14-15
    2.2 光照  15
    2.3 水分  15
    2.4 矿质养料  15-16
    2.5. CO_2浓度对肉质根膨大的影响  16
  3 肉质根膨大过程中的生理生化机制  16-33
    3.1 植物激素与肉质根形成  16-17
    3.2 源-库关系理论在肉质根膨大过程中的应用  17-18
      3.2.1 植物源-库关系理论及其应用  17
        3.2.1.1 源-库关系的概念  17
        3.2.1.2 源-库关系在生产上的应用  17
      3.2.2 肉质根膨大过程中源-库关系及同化产物的分配情况  17-18
    3.3 萝卜肉质根形成过程中蔗糖代谢相关酶研究  18-22
      3.3.1 植物体内的糖代谢  18-19
      3.3.2 蔗糖合酶(SuSy)  19-20
      3.3.3 转化酶  20-21
      3.3.4 蔗糖磷酸合成酶  21-22
    3.4 植物发育特异蛋白及根形成与相关基因表达  22-33
      3.4.1 植物春化及成花过程与特异蛋白  22
      3.4.2 胚胎发育与特异蛋白  22-23
      3.4.3 变态器官发育中的特异蛋白  23
      3.4.4 萝卜肉质根膨大过程中的特异蛋白  23-24
      3.4.5 植物根形成及相关的基因表达情况  24-33
第二章 萝卜肉质根膨大过程中生理生化研究  33-45
  1 材料与方法  33-36
    1.1 材料  33-34
    1.2 方法  34-36
      1.2.1 肉质根库活性的测定  34
      1.2.2 碳水化合物含量的测定  34
        1.2.2.1 碳水化合物含量的提取  34
        1.2.2.2 可溶性总糖的测定  34
        1.2.2.3 蔗糖含量的测定  34
        1.2.2.4 果糖含量的测定  34
      1.2.3 蔗糖代谢酶活性测定  34-35
        1.2.3.1 酶液提取  34
        1.2.3.2 蔗糖合成酶和转化酶活性测定  34-35
      1.2.4 同工酶电泳  35-36
        1.2.4.1 样品制备  35
        1.2.4.2 电泳  35
        1.2.4.3 染色  35-36
  2 结果与分析  36-41
    2.1 不同萝卜品系根冠比变化  36-37
    2.2 肉质根膨大过程中库活性变化  37
    2.3 肉质根膨大过程中碳水化合物含量变化  37-38
    2.4 肉质根膨大过程中蔗糖代谢相关酶活性变化  38-39
    2.5 萝卜叶片及肉质根不同生育期同工酶电泳  39-41
      2.5.1 EST同工酶  39-40
      2.5.2 SOD同工酶  40
      2.5.3 α-淀粉酶同工酶  40-41
  3 讨论  41-43
  参考文献  43-45
第三章 萝卜肉质根发育过程中基因差异表达分析  45-62
  1 材料与方法  45-51
    1.1 材料  45-46
    1.2 方法  46-51
      1.2.1 萝卜总RNA的提取  46
      1.2.2 总RNA的纯化  46
      1.2.3 RNA反转录  46-47
      1.2.4 差异显示PCR(DDRT-PCR)  47-48
      1.2.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  48-49
      1.2.6 染色  49
      1.2.7 cDNA差异条带的回收  49
      1.2.8 差异条带的二次扩增  49
      1.2.9 回收条带的纯化及再扩增  49
      1.2.10 转化与克隆  49-51
        1.2.10.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  49-50
        1.2.10.2 用T载体进行连接  50
        1.2.10.3 连接产物的转化  50
        1.2.10.4 挑取单克隆  50
        1.2.10.5 克隆产物的鉴定  50
        1.2.10.6 测序  50-51
  2 结果与分析  51-58
    2.1 RNA提取分析  51
    2.2 萝卜不同生育期肉质根的mRNA差异显示分析  51-52
    2.3 差异片断的回收再扩增  52-53
    2.4 差异表达基因片段的同源性分析  53-58
  3 讨论  58-60
    3.1 不同生育期肉质根材料的选择  58
    3.2 萝卜mRNA差异显示分析技术反应体系的确立及结果分析  58-59
    3.3 克隆序列的同源性分析  59-60
  参考文献  60-62
第四章 萝卜肉质根及叶片发育过程中基因组DNA甲基化水平变化分析  62-75
  1 材料与方法  63-66
    1.1 材料  63
    1.2 DNA提取及纯化  63-64
    1.3 基因组DNA的酶切与连接  64
    1.4 酶切产物预扩增  64-65
    1.5 选择性扩增  65
    1.6 电泳检测与分析  65-66
  2 结果与分析  66-70
    2.1 萝卜不同生育期叶片基因组DNA甲基化样式分析  66-68
      2.1.1 MSAP分析所产生的甲基化模式带型  66-67
      2.1.2 不同生育期叶片基因组DNA甲基化水平分析  67-68
    2.2 不同生育期肉质根基因组DNA甲基化样式分析  68-69
    2.3 不同生育期肉质根及叶片甲基化水平的改变与相关基因表达  69-70
  3 讨论  70-73
    3.1 DNA质量与酶切体系对反应结果的影响  70-71
    3.2 萝卜DNA甲基化水平的改变与生长发育的关系  71-73
  参考文献  73-75
全文结论  75-76
在读期间发表论文目录  76-77
附录  77-80
致谢  80

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 根菜类（直根类） > 萝卜
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