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肺炎嗜衣原体CPAF重组蛋白的表达、纯化及其临床诊断初步应用

作　者: 郑江花
导　师: 吴移谋
学　校: 南华大学
专　业: 病原生物学
关键词: 肺炎嗜衣原体重组蛋白 CPAF 免疫活性血清学诊断抗原检测
分类号: R374
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的:构建肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae, Cpn)蛋白酶样活性因子(Chlamydial protease–like activity factor,CPAF)免疫优势区(181～400aa, CPAFm)基因的重组表达体,在大肠杆菌中诱导表达,纯化表达产物,对其进行免疫活性分析;建立间接ELISA方法检测Cpn感染临床标本,评价重组蛋白在临床诊断中的应用价值,为制备Cpn感染快速诊断试剂盒提供实验依据。方法:通过生物信息学分析并查阅文献,筛选CPAF免疫优势区基因,以Cpn CWL029株基因组DNA为模板,高保真PCR扩增目的基因,将其亚克隆至pGEX6p-2原核表达载体中构建重组质粒,经酶切和测序鉴定后,转化至E.coli BL21中,IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定表达产物;复性后用谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)琼脂糖凝胶FF纯化重组蛋白,A280紫外分光光度法测定纯化蛋白浓度。用纯化的重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法,优化后进行可靠性试验和稳定性试验,并检测其与Ct的交叉反应。以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,用ELISA方法检测兔血清中特异性抗体效价,分析重组蛋白的免疫原性;用间接ELISA方法和Western blot分析重组蛋白的免疫反应性。间接ELISA方法与金标准方法MIF检测临床标本,评价重组蛋白在血清学诊断中的应用价值。以纯化的抗重组蛋白多克隆抗体为一抗建立间接ELISA方法,与进口PCR试剂平行检测呼吸道感染患者痰咽拭子,评价重组蛋白在抗原检测中的应用价值。结果:软件分析CPAF抗原表位并查阅文献,选择了CPAF基因第1168241~1167582bp位碱基序列为目的基因(片段长度为660bp,编码200个氨基酸),PCR扩增得到大小约700bp目的片断;构建的pGEX6p-2/CPAFm重组质粒经酶切和测序鉴定证明插入子为目的基因,测序结果与Genbank上登录序列完全一致。SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,重组工程菌表达了一相对分子质量(Mr)约51.3×103的目的蛋白,在菌体细胞内主要以包涵体形式存在,经GST琼脂糖凝胶FF纯化得到纯度达95%以上的重组蛋白,Western blot检测其能与Cpn阳性血清发生特异性反应。以重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法,可靠性试验测得平均批间变异系数(CV)为6.52%,平均批内CV为8.08%;稳定性试验测得平均批间CV为6.93%;检测Ct阳性参考血清和临床阳性血清,无一例交叉反应。检测免疫兔血清中特异性IgG和IgM抗体效价,分别高达1﹕16 000和1﹕8 000以上;检测Cpn IgG和IgM参考血清,敏感度和特异度均为100%;与MIF试剂同时检测300份临床血清标本,IgG和IgM的一致率分别为99.0%和98.3%。以纯化的抗重组蛋白多克隆抗体为一抗建立间接ELISA方法,与PCR试剂同时检测120份病人痰咽拭子中Cpn抗原,一致率为88.3%。结论:(1)成功构建了pGEX6p-2/CPAFm原核表达重组体,将其转化至E.coli后表达出一相对分子质量约51.3×103的GST-CPAFm重组蛋白;(2)重组蛋白具有良好的免疫原性,能刺激新西兰兔产生高效价的特异性IgG和IgM抗体;(3)重组蛋白具有良好的免疫反应性,能与Cpn阳性血清特异性结合,可应用于Cpn感染血清学诊断;(4)重组蛋白在Cpn感染血清学诊断和抗原检测中具有良好的应用价值。

全文目录

主要缩略语英文索引  4-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
正文  11-46
  1 前言  11-14
  2 实验材料  14-17
  3 实验方法及步骤  17-28
  4 实验结果  28-41
  5 讨论  41-45
  6 结论  45-46
参考文献  46-51
附录  51-53
文献综述  53-61
成果目录  61-62
致谢  62

肺炎嗜衣原体CPAF重组蛋白的表达、纯化及其临床诊断初步应用

内容摘要

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