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基于光镊拉曼光谱的单细胞分析方法研究

作　者: 黄超
导　师: 王强；黎永青
学　校: 广西师范大学
专　业: 计算机软件与理论
关键词: 地中海贫血肝癌拉曼光谱光镊神经网络微流控芯片
分类号: TH773
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

拉曼光谱是一种简便灵敏的光谱分析新技术,近年来在细胞的结构、功能及细胞凋亡等方面取得了迅速发展。目前,拉曼光谱已经在农业、工业、化学,生命科学等领域得到了广泛的应用,取得了明显的成效。而对于不少受布朗运动影响或会游动的细胞或生物大分子而言,使用普通拉曼光谱仪检测其拉曼光谱将十分困难。因此本文引入了激光镊子拉曼光谱技术,它是研究生物体组织分子结构的新工具。单细胞光镊拉曼光谱技术是将光学囚禁(optical trapping)与拉曼光谱分析(Raman spectroscopy)结合并应用于悬浮细胞研究的一项新的生物光子技术。其原理是利用高度会聚的激光束,囚禁溶液中的活细胞,使之固定在激光微束中,再通过瞬时增加的激光强度来激发细胞内分子的非弹性拉曼散射,从而可以收集到该细胞的拉曼光谱。将单细胞光镊拉曼光谱技术应用于从单细胞水平分析和诊断地中海贫血、癌症的研究,是一项很有意义的工作。地中海贫血(地贫)是一组由于珠蛋白基因的缺失或缺陷导致珠蛋白链合成障碍所引起的遗传性溶血性疾病。其中,α和β地贫最为常见。长期以来,地中海贫血困扰着中国南方、东南亚地区数以百万计的广大人口。广西是地贫的高发区,部分地区α地贫发生率高达15%,为全国之首,而β地贫发生率为5%。目前地贫的检测和分子生物学研究(包括血常规检测,血红蛋白(Hb)电泳分析,Hb A2及Hb F测定,DNA分析等)均是基于血样中大量细胞宏观平均的结果。同时上述的实验室检测方法相对昂贵,或操作繁琐,工作量大等,不适合大面积人群的筛查。将单细胞光镊拉曼光谱技术应用于地中海贫血的研究,有可能提供一种新的研究方法和研究角度,它可以从单细胞的层次揭示地贫引起的血红蛋白异常。同时拉曼光谱作为一种快速、简便、有效的筛查和诊断地中海贫血的方法,具有较高的学术价值和临床应用前景。通过使用光镊拉曼,可以发现在单个红细胞水平上Hb分子的异常结构,而这些异常是被宏观平均所掩盖的。同时本文研究表明,借助于拉曼光谱的主成分分析(PCA),α-地贫(HbH)和β-地贫(major)可以从单细胞拉曼光谱得到快速简便的诊断。由于癌症早期症状不明显,并且症状的多样性与一些常见的疾病非常相似,很难被及时发现。目前癌症的诊断主要是以肿瘤切片的细胞学鉴定为依据,然而非量化的病理诊断操作过程繁琐,且常带有很大的主观性。因此寻找方便、快捷、准确、无创伤的癌症早期诊断方法意义重大。拉曼光谱技术由于能从分子水平上反映正常组织与病变组织在化学组成和分子结构上的差异,可能成为一条早期诊断肿瘤的途径。本文的研究发现,肝癌细胞的拉曼光谱强度明显弱于正常肝脏细胞,且存在较为明显的差异。本文基于使用带光镊子的拉曼光谱仪(LTRS)测得的一些数据,分别使用模式识别、数据对比的方法,对地中海贫血和肝癌的拉曼光谱数据进行分析,以求找到合适的方法实现对不同病种细胞的拉曼光谱数据的有效分类。在获取数据的过程中,发现传统的光谱测试方法存在着一些不足之处,尝试提出了一套检测拉曼光谱的新方法,以求能够加快某类样本数据的采集速度,有效地提高数据的质量,并已取得初步成果,为实现光谱数据的全自动测量提供了新思路。根据作者所做的工作,分为了三个部分进行介绍。模式识别算法应用于地中海贫血的诊断。本文首先介绍采用785nm激光束构建的带有光镊子的激光拉曼光谱仪作为检测手段鉴别两类不同的地中海贫血疾病。在对原始数据进行预处理之后,使用PCA(主成分分析)算法对其进行特征提取,并采用训练好的人工神经网络进行病种分类。实验结果表明本文提出的方法对地中海贫血的快速诊断是很有意义的。光镊拉曼应用于肝癌的诊断。本文随后介绍了带有光镊子的激光拉曼光谱仪用以检测肝癌细胞拉曼光谱的技术,并对实验结果进行了简要的分析。微流控芯片与拉曼光谱仪的结合。本文最后介绍了将结合细胞电泳的微流控芯片与带有光镊子的激光拉曼光谱仪用以检测人的红细胞拉曼光谱的技术。并将实验结果与使用常规方式检测得到的单细胞光谱进行比对分析,发现这一技术将大大加快细胞的拉曼光谱检测进程,且对实验效果无明显影响。从而在国内首次成功地将微流控芯片技术与拉曼光镊结合起来,并将其运用到红细胞的拉曼光谱检测上。

全文目录

论文摘要  2-4
Abstract  4-8
第一章绪论  8-20
  1.1 课题的来源、背景及意义  8-9
    1.1.1 课题来源及目的  8
    1.1.2 实际意义及价值  8-9
  1.2 拉曼光谱的基本原理和概念  9-13
    1.2.1 拉曼散射和瑞利散射  9-10
    1.2.2 拉曼散射的解释  10-12
    1.2.3 特征拉曼频率  12-13
    1.2.4 拉曼谱线相对强度的变化率和退偏比  13
  1.3 单细胞拉曼光谱技术介绍  13-17
    1.3.1 拉曼光谱技术的产生与发展  13-14
    1.3.2 光镊拉曼的应用背景  14-16
    1.3.3 带有光镊子技术的拉曼光谱仪  16-17
    1.3.4 单细胞的拉曼光谱分析  17
  1.4 微流控芯片介绍  17-19
    1.4.1 微流控芯片分析系统的发展  17-18
    1.4.2 微流控芯片分析系统的用途及重点应用领域  18-19
    1.4.3 微流控芯片分析系统的展望  19
  1.5 本文内容安排  19-20
第二章基于PCA算法和BP神经网络联用的光镊子拉曼光谱地中海贫血病种的诊断方法.  20-34
  2.1 地中海贫血及其传统的诊断方式的缺陷  20
  2.2 使用带光镊子的拉曼光谱仪获取地中海贫血血细胞的拉曼光谱数据  20-21
    2.2.1 光谱的获得所需要的仪器与设备  20-21
    2.2.2 样品的来源与数据的获取  21
    2.2.3 所得光谱数据的预处理  21
  2.3 使用主成分分析算法（PCA）进行特征提取  21-24
    2.3.1 主成分分析算法  21-23
    2.3.2 特征提取的原则  23-24
  2.4 BP人工神经网络的训练与模式分类  24-30
    2.4.1 人工神经网络的基本概念  24-25
      2.4.1.1 人工神经网络的优点  24-25
    2.4.2 BP人工神经网络  25-27
      2.4.2.1 BP神经网络的结构  25-27
      2.4.2.2 BP神经网络的学习过程  27
    2.4.3 BP神经网络的改进方法  27-29
      2.4.3.1 BP神经网络的不足  27-28
      2.4.3.2 BP神经网络的改进  28-29
    2.4.4 PCA与BP神经网络联用的预测模型设置  29-30
      2.4.4.1 BP神经网络结构的确定  29
      2.4.4.2 网络各种参数的选定  29-30
  2.5 实验结果与分析  30-33
    2.5.1 血红细胞的显微拉曼光谱  30-31
    2.5.2 对不同病种的拉曼光谱数据作PCA处理  31-32
    2.5.3 基于数据的前三维主分量建立BP神经网络预测模型  32-33
  2.6 小结  33-34
第三章基于拉曼光镊手段的肝癌诊断技术研究  34-37
  3.1 使用拉曼光镊分析肝（肝癌）细胞的拉曼光谱的意义  34
  3.2 使用带光镊子的拉曼光谱仪获取肝（肝癌）细胞的拉曼光谱数据  34-35
    3.2.1 仪器与试剂  34-35
    3.2.2 数据获取  35
    3.2.3 所得光谱数据的预处理  35
  3.3 实验结果与分析  35-36
    3.3.1 肝癌细胞及正常人肝脏细胞的显微拉曼光谱  35-36
  3.4 小结  36-37
第四章基于微流控芯片、拉曼光镊的红细胞光谱检测技术  37-45
  4.1 材料与方法  37-39
    4.1.1 常规的单细胞拉曼光谱检测方法的不足及引入微流控芯片后的优越性  37
    4.1.2 微流控芯片分析系统的准备  37-38
    4.1.3 电泳缓冲液的配制  38-39
  4.2 实验部分  39-40
    4.2.1 芯片清洗  39
    4.2.2 操作步骤  39-40
  4.3 实验结果  40-45
第五章总结与展望  45-47
  5.1 论文总结  45
  5.2 论文进一步研究的展望  45-47
参考文献  47-49
攻读硕士期间发表的论文  49-50
致谢  50-51

基于光镊拉曼光谱的单细胞分析方法研究

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