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水稻GATEWAY RNA干涉技术的建立及应用研究

作　者: 李小汀
导　师: 吴平
学　校: 浙江大学
专　业: 遗传学
关键词: 水稻根系 RNAi Gateway Cloning System RT-PCR
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 287次
引　用: 1次
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内容摘要

RNA干涉(RNAi)是基因表达调控的一种重要机制，是由双链RNA诱导产生的转录后水平的同源基因沉默现象。RNA介导的基因沉默具有特异性强、效率高等特点，近年来逐渐发展成为适于大规模研究基因功能的反向遗传学手段。利用位点特异性重组的基因克隆技术Gateway Cloning System进行RNAi转基因研究被认为是一种高效率的RNAi研究技术。本研究选择了在水稻根系发生发育过程中特异表达的13个基因为候选基因，利用PCR技术从水稻基因组DNA中扩增出相应基因的GSTs片段。通过位点特异性重组的基因克隆技术Gateway Cloning System，构建了包含有intron的发夹结构RNA载体，经农杆菌介导的遗传转化获得了水稻转基因植株。取野生型植株及转基因植株的根部样品，RT-PCR检测候选基因的表达量显示，转基因植株中目的基因的表达量较其在野生型中的表达量有明显的降低。研究结果证明，利用Gateway Cloning System大规模构建RNAi载体并转化植株，可以实现高效的基因沉默。

全文目录

致谢  7-8
摘要  8-9
ABSTRACT  9-10
缩略语表  10-11
第一章文献综述  11-21
  1.1 RNA干涉(RNAi)技术的研究进展与应用  11-15
    1.1.1 功能基因组学与反向遗传学的发展  11
    1.1.2 RNA干涉的研究进展  11-13
    1.1.3 RNA介导的基因沉默的应用  13-14
    1.1.4 RNA介导的基因沉默与传统技术相比的优势  14-15
  1.2 Gateway Cloning System 的发展及应用  15-19
    1.2.1 Gateway Cloning System的原理  15-17
    1.2 2 Gateway Cloning System在基因沉默中的应用  17-19
  1.3 研究背景  19-21
第二章材料与方法  21-40
  2.1 实验材料  21-22
    2.1.1 植物材料  21
    2.1.2 质粒和菌株  21
    2.1.3 酶和试剂  21
    2.1.4 培养基  21-22
  2.2 实验方法  22-40
    2.2.1 水稻基因组 DNA的提取  22-23
    2.2.2 Gateway Cloning System构建 RNAi载体  23-32
    2.2.3 RNAi载体的农杆菌转化  32-34
    2.2.4 农杆菌介导法转化水稻  34-36
    2.2.5 转基因植株的分子鉴定  36-40
第三章结果与分析  40-44
  3.1 RNAi载体的构建  40-42
    3.1.1 PCR扩增获得目的基因 GSTs片段  40
    3.1.2 TOPO反应获得含有 GSTs片段的中间载体  40
    3.1.3 LR反应获得ihp-RNA表达载体  40-42
  3.2 农杆菌介导法获得转基因植株  42
    3.2.1 农杆菌介导法获得 RNAi载体的转基因植株  42
    3.2.2 潮霉素筛选验证阳性转基因幼苗  42
  3.3 RT-PCR检测转基因植株目的基因表达量  42-44
第四章讨论  44-46
参考文献  46-50

水稻GATEWAY RNA干涉技术的建立及应用研究

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