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用蛋白质组学技术筛选水稻抗白叶枯病相关蛋白

作　者: 余初浪
导　师: 杨玲
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 体细胞杂交水稻白叶枯病叶片双向电泳
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

水稻(Oryza sativa L．)不仅是我国的第一大农作物，也是单子叶的模式植物，在生产实践和科学研究中都占有极其重要的地位。水稻全基因组测序的完成宣告了水稻功能基因组学时代的到来。蛋白质组学是在蛋白质整体水平上研究基因的功能，是近几年来生命科学研究领域的一大热点，是生命科学进入功能基因组时代的标志之一。我们以Bio-Rad高通量双向电泳系统为技术平台，通过改进和优化水稻叶蛋白的提取方法及电泳条件，建立了适合水稻叶总蛋白的高通量、高分辨率和高重复性的双向电泳技术体系。在水稻叶蛋白双向电泳图谱上能检测到至少1000个蛋白点。两次重复实验的双向电泳图谱的相关系数为0.964。由水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo)引起的白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害，是研究植物与病原细菌互作的模型系统。本论文利用自己建立的双向电泳技术体系分析了水稻体细胞杂交抗病新种质叶片在接种Xoo非亲和小种ZHE173后24 h、48 h、72 h的蛋白质组变化情况，得出如下结果：1．接种Xoo后48 h可能是在蛋白质水平上水稻与白叶枯病菌非亲和互作反应的关键时间。我们发现共有77个蛋白点在接种Xoo后表达发生显著变化。其中17个蛋白点在处理的3个时间点均发生了差异表达，8个蛋白点在24 h和48 h差异表达，20个蛋白点在48 h和72 h发生差异表达，31个蛋白点只在48 h差异表达以及1个蛋白点只在24 h差异表达。77个差异表达蛋白点中，有76个点在48 h呈现表达差异。2．分离出3个之前未曾报道过的水稻抗病相关蛋白。植物硫肽激素受体前体(PSKR)属于丝氨酸／苏氨酸激酶家族，具有富含亮氨酸重复区(LRR)和丝氨酸／苏氨酸激酶结构域(STK)，定位于膜上，通过结合植物硫肽激素引发胞内信号转导。磷脂酰肌醇-3激酶相关蛋白激酶(PIKK)是一类调控细胞生长、基因表达和基因组监测及修复的信号蛋白，PIKKs蛋白家族在真核细胞应答各种胁迫中扮演着重要的角色。生长素调节蛋白是一类由生长素调节基因家族编码的蛋白。序列分析表明，该蛋白含有2个重复的谷胱甘肽S-转移酶(GST)的N末端结构域。3．叶绿体可能是受Xoo侵染影响最大的一个细胞器。利用TargetP程序对64个被鉴定的差异蛋白进行亚细胞定位预测，23个蛋白点定位于具体的细胞器上，而其中有15个蛋白定位于叶绿体上。Xoo侵染后，1，5-二磷酸核酮糖羧化加氧酶大亚基(RcLb)的大片段表达下调，而小片段表达上调，推测RcLb及其片段发生了降解，并使用免疫印迹技术加以验证。本研究首次利用蛋白质组学方法分析以疣粒野生稻为抗源的体细胞杂种在Xoo侵染后的蛋白质组变化情况，揭示了抗病新种质对Xoo的抗性是通过一个复杂的胞内调控网络来实现的。在77个差异表达蛋白中，有64个得到鉴定，其中51个已知功能的蛋白可以被分为5类：光合作用相关蛋白、抗氧化防御蛋白、蛋白更新、信号转导和代谢。利用TargetP程序对64个被鉴定的差异蛋白进行亚细胞定位预测，其中15个蛋白定位在叶绿体，8个蛋白定位在线粒体上。因此，要全面阐述水稻抗病新种质对Xoo的抗性机理还需进行亚细胞差异蛋白质组学的研究。同时对新的抗病相关蛋白的进一步研究也将有利于揭示水稻抗病新种质对Xoo的抗性机理。

全文目录

中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
缩略词表  13-14
第一部分文献综述  14-29
  一、水稻白叶枯病研究进展  14-21
    1 水稻白叶枯病简介  14
    2 水稻白叶枯病抗病分子机制的研究  14-20
    3 水稻白叶枯病的抗性育种  20-21
  二、蛋白质组学及其在水稻抗病机理研究方面的应用  21-29
    1 蛋白质组学产生的背景和意义  21
    2 蛋白质组学研究技术  21-25
    3 植物蛋白质组学发展概况  25
    4 蛋白质组学在水稻抗病机理研究方面的应用  25-29
第二部分研究论文  29-53
  第一章水稻叶总蛋白双向电泳体系的建立  29-39
    一、材料与方法  29-34
      1 供试材料  29
      2 仪器设备和试剂  29
      3 试验方法  29-34
        3.1 水稻培养  29
        3.2 水稻叶总蛋白的提取  29-30
        3.3 蛋白定量  30
        3.4 第一向IEF  30-32
        3.5 第二向SDS-PAGE电泳  32-33
        3.7 染色  33-34
        3.7 凝胶扫描和图像分析  34
    二、结果  34-36
    三、讨论  36-39
  第二章水稻体细胞杂交新种质白叶枯病菌胁迫下的差异蛋白质组学研究  39-53
    一、引言  39
    二、材料与方法  39-43
      1 供试材料  39
      2 仪器设备和试剂  39-40
      3 试验方法  40-43
        3.1 水稻培养  40
        3.2 白叶枯病菌培养  40
        3.3 接种和取样  40
        3.4 水稻叶总蛋白的提取  40
        3.5 蛋白定量  40
        3.6 第一向IEF  40
        3.7 第二向SDS-PAGE电泳  40
        3.8 染色  40-41
        3.9 凝胶扫描和图像分析  41
        3.10 差异蛋白的胶内酶解和肽质量指纹谱(PMF)分析  41-42
        3.11 数据库搜索  42-43
        3.12 蛋白的亚细胞定位  43
        3.13 免疫印迹分析  43
    三、结果  43-49
      1 白叶枯病菌胁迫下的水稻叶蛋白双向电泳分析  43-44
      2 接种48h后差异表达蛋白质的PMF分析  44-47
      3 白叶枯病响应蛋白的功能分类和亚细胞定位  47-49
    四、讨论  49-52
      1 5个参与抗病信号传导的蛋白  49-50
      2 3个参与抗氧胁迫的蛋白表达上调  50-51
      3 35个光合作用相关蛋白在Xoo侵染后48h差异表达  51-52
    五、结论  52-53
参考文献  53-62
附录  62-65
致谢  65-66
攻读学位期间发表的学术论文  66-67

用蛋白质组学技术筛选水稻抗白叶枯病相关蛋白

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