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肺炎衣原体膜表面蛋白（OMP）基因重组质粒的构建与表达

作　者: Biani Germain K（毕阿尼）
导　师: 陈智
学　校: 浙江大学
专　业: 内科学
关键词: 肺炎衣原体重组质粒膜表面蛋白免疫印迹
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

[研究背景]肺炎衣原体(Chlmydia pneumonia，C．pn)是1989年命名的一种呼吸道感染的重要病原体，属致病性衣原体的第三个种。C．pn只有一个血清型，具有独特的发育周期，原体(EB)具有感染性，主要通过脂多糖(LPS)、热休克蛋白(heat shock protein，HSP)、主要外膜蛋白(main out membrane protein，MOMP)及某些细胞因子致病。C．pn致病广泛，可引起肺炎、咽喉炎、支气管炎、哮喘等慢性呼吸道感染，同时也与冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、心内膜炎等心血管疾病密切相关。C．pn在世界各地流行很广，因而受到人们的极大关注。目前C．pn的实验室检查方法有病原学检查、特异性核酸检测、特异性抗体测定等。但临床上尚无快速、方便的检测手段，亦无有效可行的预防措施。作为专性活细胞内寄生的微生物，细胞培养法分离检测C．pn时间长、操作复杂，不利于临床快速诊断；而采用扩增DNA的多聚酶链反应技术(PCR法)，虽具有快速、简便、灵敏的特点，但进 PaPer ofPOstgraduate，Zhejiang University行P CR检测时应注意质量控制，其准确性易受标本中杂质干扰和试验人员技术水平影响，目前不适合做常规诊断。核酸杂交主要用于PCR扩增结果的确诊以及提高诊断的敏感性，但由于实验仪器设备要求较高，尚未直接用于临床标本的检测。特异性抗体测定，主要是免疫荧光标记技术是目前C.Pn感染最为敏感的检测方法，被公认为是感染血清学诊断的金标准法。在许多国家和医疗单位，采用微量间接免疫荧光法(MIF)检测特异性抗体的方法己厂一泛用于流行病学研究和临床感染诊断。MIF检测试剂所用的抗原为C.pn的膜表面抗原。文献资料表明，C.Pn的外膜蛋白(OMP)具有良好的免疫原性，其抗体有免疫保护性。此外，通过大肠杆菌等基因工程菌获得重组蛋白，其免疫原性良好，且整个生产费用较低，亦可大量用作分离纯化。因此，我们在前人实验的基础上，通过PCR扩增获取C.Pn膜表面蛋白(OMP)基因，构建了C.Pn OMP的重组质粒并获得C.Pn重组蛋白，测定其免疫反应性，以制备应用于临床检测试剂盒的抗原。〔实验目的」构建肺炎衣原体膜表面蛋白(OMP)基因的重组质粒PGEX一SX一3一OMP，并通过基因工程菌获得C.Pn的重组蛋白，作为临床检测试剂盒的抗原，或用以新型疫苗的开发与研制。[材料与方法〕1.制备pGEX一sx一3质粒:pGEx一sx一3质粒转化大肠杆菌oH5a菌株，扩增阳性克隆，以碱裂解法小量制备载体。 7 Paper of Postgr3duate，Zhejiang University2.PCR扩增C.pn OMP基因:设计并合成C.Pn OMP基因的上下游引物，引物两端含有与载体匹配的酶切位点，PCR扩增获取C.pn OMP基因片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定。3.构建pGEX一SX一3一0柳重组质粒:OMP片段及载体PGEX一SX一双酶切后连接，转化感受态大肠杆菌DHSQ，双酶切鉴定阳性克隆;阳性克隆转化至表达菌株BLZI( DE3)菌株。4.SDS一队GE测定重组蛋白分子量:表达菌株经IPTG诱导后SDS一PAGE电泳，考马斯亮蓝R25O染色，脱色液至本底透明后成像摄片。5.western blot鉴定融合蛋白的免疫反应性:将凝胶通过电转膜至硝酸纤维素滤膜，分别加入一抗、二抗反应，DAB显色后观察特异性结合条带。「结果〕1.X一3质粒pGEX一小量制备质粒pGEX一SX一3转化大肠杆菌DHSQ后，在含有氨节青霉素的LB琼脂平板中菌落均匀生长，抽提质粒后电泳鉴定可见3条清晰条带。2. C.pn0Mp基因的扩增经PCR反应获取C.Pn OMP的基因片段，电泳证实DNA片段与预计的长度相同，OMP为0.6kb。3.丙Ex一SX一3一服P重组质粒的构建以PCR和酶切方法筛选鉴定pGEX一SX一3~OMP重组质粒，测序证实目的基因片段已完整无误的插入pGEX一SX一3载体。 8Paper of POs匆钊uate，Zhejiang University4.沁EX一SX一3一OMP重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达 pGEX一SX一3一OMp重组质粒转化BLZI(DE3)菌株后，PCR法检测基因发现转化了pGEX一5X一3一OMP的菌株出现一条0.6Kb的阳性条带，提示转化成功。经SDS一队GE验证，结果转化了pGEX一SX一3一OMP的菌株〔结论〕1.本实验成功构建了重组质粒pGEX一SX一3一OMP，经序列分析证实序列无误。2.505一PAGE证实重组质粒pGEX一SX一3一OMP在大肠杆菌BL21(DE3)中能够成功表达OMP融合蛋白。3.免疫印迹法证实重组质粒pGEX一SX一3一OMP转化的大肠杆菌BLZI(DE3)表达的融合OMP蛋白具有免疫反应性。

全文目录

ENGLISH ABSTRACT  3-8
CHINESE ABSTRACT  8-12
CASE ANALYSIS  12-28
  Abstract  12-13
  INTRODUCTION  13-14
  PATIENTS AND METHODS  14-16
  RESULTS  16-23
  DISCUSSIONS  23-25
  CONCLUSIONS  25-26
  REFERENCES  26-28
REVIEWS  28-46
  1． REVIEWS ONE  28-39
  2． REVIEWS TWO  39-46
ACKNOWLEDGEMENTS  46

肺炎衣原体膜表面蛋白（OMP）基因重组质粒的构建与表达

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