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重金属的雌激素样效应及其机制研究

作　者: 周巧巧
导　师: 熊丽
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 重金属雌激素活性重组基因酵母法小鼠子宫增重法半定量RT-PCR
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 25次
引　用: 1次
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内容摘要

环境雌激素在人体或动物中发挥着类似天然雌激素的作用,它参与的调控网络十分复杂,对生物体的影响也是多方面的,特别是对生殖系统的危害成为研究热点。本研究首先测定了Cd和Hg两种重金属的体外雌激素活性,随后分别对刚断乳雌性昆明小鼠进行3天急性腹腔注射染毒实验,通过传统的子宫增重法检测其子宫增重效应,通过HE染色切片法测量子宫内膜上皮细胞高度来检测其上皮细胞增厚效应,同时以半定量RT-PCR法检测其对雌激素受体α(ERα)和β(ERβ)基因表达的影响,并对各组数据取对数之后分析不同方法之间的相关性以期建立简单易行、快速低廉的筛查方法,然后本研究还进一步探讨了Cd和Hg可能参与的调控途径,并且检测了ERα和ERβ基因对17β-雌二醇(E2)与环境雌激素(EEs)的敏感性。结果显示在95%的置信区间内,E2对酵母β-半乳糖苷酶诱导活性的EC50值为5.10×10-10mol·L-1,最大酶活为6.48 U。Cd在浓度为1.0×10-8mol·L-1时对酵母β-半乳糖苷酶诱导活性最大,为2.60U,0.40倍于E2诱导的最大酶活；Hg在浓度为5.0×10-7mol·L-1时对酵母β-半乳糖苷酶诱导活性最大,为0.93U,0.14倍于E2的最大酶活,但是在各自暴露剂量范围内不能求出它们的EC50值。实验结果表明尽管难以通过重组基因酵母法测定出Cd和Hg的EC50值,但它们在一定的浓度范围内具有雌激素活性,该浓度即为最大雌激素活性浓度,若一味计算EC50值不仅难以评价重金属的雌激素活性,而且局限重组基因酵母法的普遍运用。同时,若构建出含ERβ基因的双杂交酵母菌株,与现有的方法互补将能完善环境雌激素的体外测评系统。将Cd和Hg对17d昆明小鼠进行染毒实验检测其体内雌激素活性,结果表明仅2000μg/kg.bw组Hg发挥着重金属毒性作用,其他组的重金属发挥着雌激素效应。在子宫增重实验中除了Hg 2000μg/kg.bw和E2组与对照相比呈极显著差异,Cd 930μg/kg.bw呈显著性差异外,其他组均无显著性差异；在子宫HE染色切片法中,Cd各染毒组均呈显著差异,其他组与对照呈极显著差异；半定量RT-PCR实验表明,ERa和ERp在卵巢组织中的表达量均高于其在子宫中的水平,但Cd和Hg染毒组剂量效应关系并不明显。数据分析显示子宫内膜上皮细胞高度与子宫增重两者由共同的因素调控,可以通过子宫增重法的实验结果来预测HE染色切片的结果,但是作为病理学指标子宫内膜上皮细胞高度比子宫增重更灵敏,更具有早期预警效应。同时ERa和ERp的mRNA检测结果表明ERp表达水平与子宫增重法的相关性高于ERα与子宫增重法的相关性,这也说明通过ERβ来构建EEs的筛查系统也许比ERa更加接近动物体内系统。但通过mRNA表达来筛查EEs的方法灵敏度和稳定性还有待完善,以期与子宫增重法和子宫内膜上皮细胞增厚法相互补充。以ERα和ERβ的表达水平检测作为生物标志物来测定化合物的雌激素活性,具有前瞻性,能预测对动物的体内效应,但同时还应积极探索易于检测的小分子作为EEs检测的生物标志物。若能将ERa和ERp应用到生物传感器上在线监测环境水体中的EEs水平,将具有广阔的应用前景。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
主要英文缩略词  8-11
第一章文献综述  11-23
  1.1 环境内分泌干扰物概述  11-13
    1.1.1 环境内分泌干扰物定义  11
    1.1.2 环境雌激素的危害  11
    1.1.3 国内外研究现状  11-12
    1.1.4 环境内分泌干扰物的分类  12-13
  1.2 环境内分泌干扰物的筛查体系  13-15
  1.3 类固醇激素受体概述  15-17
    1.3.1 ERα与ERβ的结构  15
    1.3.2 ERα与ERβ的基因分子结构  15-16
    1.3.3 ERα与ERβ基因的辅助因子  16
    1.3.4 ERα与ERβ受体的分布与调控  16-17
  1.4 ERα与ERβ依赖的调控网络  17-19
    1.4.1 乳腺癌细胞中ERα与ERβ依赖的调控网络  17-18
    1.4.2 环境雌激素在细胞内的经典信号通路  18
    1.4.3 EEs对大鼠子宫在分子、组织与器官水平的效应  18-19
  1.5 YES筛查EEs的机理  19-20
  1.6 重金属雌激素活性的研究现状  20-21
    1.6.1 重金属雌激素活性的研究概述  20
    1.6.2 Cd雌激素活性的研究概述  20-21
    1.6.3 Hg的雌激素活性研究  21
  1.7 本研究的目的及意义  21-23
第二章双杂交酵母菌株检测镉与汞的雌激素样活性  23-28
  2.1 引言  23
  2.2 材料与方法  23-24
    2.2.1 材料  23
    2.2.2 菌株  23
    2.2.3 主要试剂  23
    2.2.4 主要实验仪器  23-24
  2.3 酵母雌激素测定方法  24
  2.4 结果与分析  24-27
  2.5 讨论  27-28
第三章镉与汞的体内雌激素样活性  28-42
  3.1 引言  28
  3.2 材料与方法  28-29
    3.2.1 材料  28
    3.2.2 主要仪器  28-29
    3.2.3 引物合成  29
  3.3 实验方法  29-31
    3.3.1 染毒  29-30
    3.3.2 HE染色组织切片方法  30
    3.3.3 RNA提取与cDNA合成  30
    3.3.4 小鼠组织RNA的提取——Trizol法  30
    3.2.5 小鼠组织cDNA的合成——两步法RT-PCR  30
    3.3.6 PCR反应的条件  30-31
  3.4 结果与分析  31-40
    3.4.1 各组脏器系数  31-33
    3.4.2 子宫内膜上皮细胞厚度  33-35
    3.4.3 RT-PCR实验结果  35-38
    3.4.4 三种体内测试终点的相关性  38-40
  3.5 讨论  40-42
主要结论  42-43
参考文献  43-49
硕士期间发表的论文  49-50
致谢  50-51

重金属的雌激素样效应及其机制研究

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