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氯通道阻断剂对H_2O_2损伤肺血管内皮细胞的保护作用

作　者: 薛军
导　师: 张丙芳；戚好文
学　校: 中国人民解放军第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: 氯离子通道阻断剂肺血管内皮细胞氧化应激过氧化氢钙离子
分类号: R563
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

肺与氧关系最密切，有越来越多的证据表明，活性氧（ROS）和氧自由基（OFR）与肺损伤有着十分密切的关系，它们对各种肺细胞均有不同程度的损害，其中对肺血管内皮细胞（VEC）损伤最重。细胞损伤时，胞内钙离子浓度([Ca²⁺]_i)一般会升高，[Ca²⁺]_i的升高，可激活氯离子通道，通过一系列作用，对细胞膜、线粒体和DNA等产生损伤或加速不可逆的细胞死亡，但其确切机制目前还不十分清楚。氯离子通道在心肌细胞、平滑肌细胞和肾脏细胞作用的研究较多，氯离子通道与肺细胞的关系及氯通道阻断剂作用的研究则相对较少，应用氯离子通道阻断剂对细胞氧化损伤保护作用的报道更少。已有学者观察到氯离子通道阻断剂对H₂O₂诱导的肾小管上皮细胞损伤具有保护作用，但对Cl^-通道是否参与氧化剂诱导肺细胞损伤的病理生理过程，以及Cl^-通道阻断剂对氧化损伤的肺细胞是否有保护作用尚不清楚。本实验以H₂O₂为活性氧刺激因子，选择体外培养的牛肺动脉内皮细胞（PAEC）为研究对象，观察H₂O₂作用前后及加入Cl^-阻断剂后对PAEC的影响，确定Cl^-阻断剂是否具有保护作用，并初步探索其作用机理。实验方法：实验分4组，即A组：对照组；B组：H₂O₂损伤组（B₁，B₂，B₃代表不同浓度H₂O₂组）；C组：H₂O₂+5-硝基-2（3-苯丙胺）-苯甲酸[5-nitro-2-（3-phenylprophlamino）-benzoate,NPPB]组（C₁，C₂为不同浓度NPPB组）；D组：H₂O₂+硝氟咪酸（niflumic acid, NFA）组（D₁，D₂为不同浓度NFA组）。原代培养健康小牛肺动脉内皮细胞，传代2次后冻存，取2～4代的细胞进行实验。以H₂O₂诱导体外培养的肺动脉内皮细胞损伤，观察Cl^-通道阻断剂对第四军医大学硕士学位论文各组细胞活力、细胞膜流动性、乳酸脱氢酶几DH)释放量、三磷酸腺音（ATP）含量、DNA降解程度和［CaZ勺；的影响。细胞活力检测采用 MTT比色法，并以MH值代表细胞活力，观察细胞的总体损伤水平，确定NPPB和NFA对细胞损伤的保护作用。细胞膜流动性采用荧光偏振法测定HZOZ对细胞膜的损伤程度及NPPB和NFA对细胞膜的保护作用。各组细胞LDH释放量和ATP含量则分别用紫外分光光度计和荧光光度计测定，观察HZOZ对PAEC线粒体功能的损伤和氯通道阻断剂的保护作用。用琼脂糖凝胶电泳法，观察各组细胞DNA损伤片段的变化，分析HZOZ对PAEC细胞DNA的损伤程度及氯通道阻断剂的保护作用。用激光扫描共聚焦显微镜观察PAEC细胞HZOZ作用前后及加入NppB或NFA后，＊勺i的变化情况，以探讨氯通道阻断剂保护作用机制及与C4“之间的关系。实验结果：（）细胞活力：MH值A组为：o．623土o．o21；B组为o．2叮9土0＊27；C组为0．419土0＊ZI；D组为0．459土0＊23。B组MTT值显著低于A组（P＜0刀1人说明B组细胞活力较A组明显降低：C组和D组细胞活力较B组明显提高（P＜o刀1）。（二）细胞膜流动性：各组微粘度n分别为：A组1石06士o＊ic；B组3．417士o．013：C组2．306土o＊1二；D组二．169土队＊1耳。B组与A组相比n值明显升高0功刀1）厂组和D组均较B组明显降低0＜0刀5X可见NPPB和NFA对细胞膜具有一定的保护作用。（3）LDH释放量：A组3二％士o．7％；B组36．9％土1．4％；C组1工4％土O．4％：D组6．4％士0．6％，B组与 A组相比 LDH释放量明显升高（P＜0．of），C组和 D组均较 B组明显降低（P＜0．of）。ATP含量：A组30．89nmol／mg蛋白质；B组 10．71 nmol／mg蛋白质；C组 18．22 nmoUmg蛋白质；D组 ZI．96 nmol／mg蛋白质，B组与 A组相比 ATP含量明显降低0＜0刀 1)刀组和 D组均较 B组明显升高（P＜刀5卜说明 NPPB和 NFA对线粒体也有保护作用。（4）琼脂糖凝胶电泳：A组 DNA结构保持完整，电泳胶上无任何片段可见。B组则形成许多小的连续的DNA损伤片段，电泳胶上可见从 500hp开始的连续小片段。C组和 D组降解片段 ·4· 第四军医大学硕士学位论文的亮度明显降低，NFA的作用最显著，电泳胶上DNA降解片段的含量极低。（5）［Caf勺；：H。O。作用后pAEC的［Caf勺i明显升高，并可稳定于较高水平，加入NppB和NFA后，［Caf勺i有较大幅度的降低，尤其是NFA作用后降幅更明显。结论：（）氯离子通道参与了HZOZ诱导的肺血管内皮细胞氧化应激损伤的病理过程。门）氯离子通道阻断剂NPPB和 NFA对 HZOZ诱导的肺血管内皮细胞损伤具有保护作用。门)对”作为第二信使和信号转导的重要分子，在肺血管内皮细胞氧化损伤中起重要作用。（4）氯离子通道阻断剂NPPB和NFA可能通过对CaZ”的调节而起到保护受损细胞的作用。

全文目录

英文缩写词表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-14
第一部分牛肺动脉内皮细胞的培养，鉴定，传代和冻存  14-18
  材料  14-15
  方法  15-16
  实验结果  16
  讨论  16-18
第二部分氯通道阻断剂对氧化损伤PAEC细胞活力和细胞膜流动性的影响  18-27
  原理  18-19
  材料  19
  方法  19-23
  实验结果  23-24
  讨论  24-27
第三部分氯通道阻断剂对氧化损伤PAEC线粒体的保护作用  27-31
  材料  27
  方法  27-28
  实验结果  28-29
  讨论  29-31
第四部分氯通道阻断剂对氧化损伤的PAEC DNA降解和[Ca~(2+)]_i的影响  31-35
  一、氯通道阻断剂对氧化损伤的PAEC DNA降解的影响  31-32
    材料  31
    方法  31-32
    实验结果  32
  二、氯通道阻断剂对氧化损伤的PAEC[Ca~(2+)]_i的影响  32-33
    材料  32
    方法  32-33
    实验结果  33
  三、讨论  33-35
结论  35-36
附图  36-40
致谢  40-41
文献回顾  41-59
参考文献  59-64

氯通道阻断剂对H_2O_2损伤肺血管内皮细胞的保护作用

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