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斯氏假单胞菌高效固氮工程菌株的构建及其与高光合水稻互作的研究

作　者: 闫春玲
导　师: 张保明；林敏
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: 固氮斯氏假单胞菌A1501 四碳二羧酸运输系统转pepc基因高光合水稻
分类号: S144
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

水稻联合固氮菌的固氮作用影响水稻生长及光合作用。构建碳源利用能力增强的固氮工程菌株，将它施用具有高光合速率的转基因水稻可以研究二者之间的互作。固氮斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501是存在于水稻根际的联合固氮菌。四碳二羧酸运输系统（Dicarboxylate acids transport system,Dct-系统）是固氮菌的能量运输系统。本研究采用具有高频接合转移特性的Tn5-mob自杀性质粒，构建了Tn5：dctPQM重组质粒，定名为pSZY6。在helper质粒pRK2013的协助下，采用三亲接合试验方法，携带A1501四碳二羧酸运输结构基因dctPQM的重组质粒pSZY6导入野生型菌株A1501中，在选择性平板上筛选染色体上含有额外拷贝dctPQM基因的重组菌株。其中3株菌株在利用四碳二羧酸生长时，表现了较高的固氮活性，暂定名为A142、A115、A136。在不同四碳二羧酸作为唯一碳源生长时，重组菌株利用三种碳源的固氮活性不同：其中琥珀酸＞延胡索酸＞苹果酸。在碳源充足或限制条件下（四碳二羧酸在培养基中浓度分别为20mM、10mM、5mM），A142的固氮活性随二羧酸浓度提高而增强，并且均高于野生型菌株A1501。将重组菌株A115和野生型菌株A1501施用转pepc基因的“9516”高光合水稻和原种水稻，采用¹⁵N和¹⁴C-同位素标记技术，研究水稻光合作用和固氮菌固氮作用之间的互作。结果表明：施用固氮菌后，转pepc基因水稻的净光合速率、荧光动力学参数（Fv／Fm）和PEPC酶活性有显著提高，生物学产量和经济产量分别增加了38.08％和26.86％。与原种比较，转pepc基因水稻明显提高固氮菌尤其是重组菌株的固氮效率和固氮总量。将重组菌株A115、A142和野生型菌株A1501施用土壤氮和有机质含量低的辽宁省盘锦市盐碱地稻区，发现施用固氮菌加速水稻分蘖，增加水稻植株的粗蛋白含量，增强根系活力，并促进水稻生长，尤其是含有额外拷贝dctPQM基因的重组菌株作用最显著。并且固氮菌与有机肥配合施用效果明显优于与化肥配施。通过设计特异性引物，采用PCR方法克隆了A1501四碳二羧酸结合蛋白编码基因dctP的启动子区，并将dctPp克隆到具有自主转移特性、在革兰氏阴性细菌中稳定存在的质粒载体pLA2917上，然后在dctPp携带的编码区上引入lacZ基因，构建了dctP-lacZ融合基因表达载体。采用两亲接合试验方法，将dctP-lacZ接合转移入P.stutzeri野生型菌株A1501、RpoN突变株、DctB^-突变株中，在含X-gal的选择性平板上筛选转接合子。结果表明：dctP基因为诱导型表达；dctP为σ⁵⁴依赖型启动子；中国农业科学院硕士学位论文DctB突变，dctP不表达，说明dCtP基因的表达需要额外的转录激活因子；葡萄糖和乳酸不诱导dctP基因的表达，葡萄糖抑制dctP基因表达水平，四碳二颗酸摇滚酸对dCtP基因表达的诱导水平高于延胡索酸。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第一章文献综述  11-25
  1.1 生物固氮对于农业可持续发展的重要意义  11-12
    1.1.1 氮肥在农业生产中具有巨大作用  11
    1.1.2 我国土壤氮素总体水平缺乏  11
    1.1.3 生物固氮将在可持续农业生产中扮演重要角色  11-12
    1.1.4 联合固氮在生物固氮过程中具有重要作用  12
  1.2 解决联合固氮效率低下问题的主要途径是提高能源供应  12-13
  1.3 固氮菌中的四碳二羧酸运输系统  13-23
    1.3.1 Dct系统是生物固氮过程中的能量转运系统  13-15
      1.3.1.1 对共生固氮  13-14
      1.3.1.2 对联合固氮  14-15
    1.3.2 Dct系统的遗传组织结构及表达调控机制  15-22
      1.3.2.1 Dct系统的遗传组织结构  15-20
      1.3.2.2 Dct系统的表达调控机制  20-22
    1.3.3 Dct系统的底物范围及对生物体其他性状的影响  22-23
    1.3.4 Dct系统改造对生物固氮的意义  23
  1.4 本工作立题依据和研究内容  23-25
第二章含额外拷贝dctPQM基因工程菌株的构建及其生理特性的研究  25-42
  2.1 实验材料  25-27
    2.1.1 菌株和质粒  25-26
    2.1.2 细菌培养  26
    2.1.3 培养基  26-27
    2.1.4 试剂  27
  2.2 实验方法  27-32
    2.2.1 含dct基因克隆大片段的序列测定  27
    2.2.2 含固氮斯氏假单胞菌dctPQM基因穿梭转移质粒的构建  27-29
    2.2.3 含额外拷贝dct结构基因工程菌株的构建  29
    2.2.4 含额外拷贝dct结构基因工程菌株的鉴定  29-31
      2.2.4.1 细菌总DNA的提取  30
      2.2.4.2 工程菌株nptⅡ-PCR检测  30-31
    2.2.5 菌株固氮活性测定  31-32
  2.3 结果与分析  32-40
    2.3.1 四碳二羧酸转移酶系编码基因dctPQM的结构分析  32-35
      2.3.1.1 不同菌属中四碳二羧酸结合蛋白序列同源性比较  32-33
      2.3.1.2 固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运蛋白的结构预测  33-35
    2.3.2 含额外拷贝dct结构基因工程菌株的构建  35-37
      2.3.2.1 固氮斯氏假单胞菌dct基因簇序列结构示意图  35-36
      2.3.2.2 携带dctPQM基因自杀性转移质粒的构建  36
      2.3.2.3 重组质粒的酶切鉴定  36-37
    2.3.3 含额外拷贝dct结构基因工程菌株的鉴定  37-38
    2.3.4 含额外拷贝dct结构基因工程菌株固氮活性的测定  38-40
  2.4 讨论  40-42
第三章含额外拷贝dct结构基因工程菌株与转pepc基因高光合水稻间的互作  42-50
  3.1 材料与方法  42-44
    3.1.1 供试材料  43
    3.1.2 试验处理  43
    3.1.3 光合生理指标测定  43
    3.1.4 植株~(15)N测定  43
    3.1.5 ~(14)C-同化物的标记和测量  43-44
  3.2 结果与分析  44-48
    3.2.1 施用不同固氮菌对转pepc基因水稻光合特性的影响  44-45
    3.2.2 水稻联合固氮菌对转含pepc基因水稻光合作用的影响  45-46
    3.2.3 施用不同固氮菌对转pepc基因水稻产量性状的影响  46-47
    3.2.4 转pepc基因水稻对P.stutzeri固氮能力的影响  47-48
  3.3 讨论  48-50
第四章固氮斯氏假单胞菌dctP基因表达调控机制的研究  50-64
  4.1 材料和方法  50-56
    4.1.1 菌株和质粒  50
    4.1.2 细菌培养  50-51
    4.1.3 试剂  51
    4.1.4 质粒DNA的提取  51-52
    4.1.5 采用PCR扩增方法获得dctP基因启动子区  52-54
    4.1.6 dctP-lacZ融合基因导入野生型菌株A1501和RpON, DctB~(-)突变株  54-55
    4.1.7 β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)活性的测定  55-56
  4.2 结果和分析  56-62
    4.2.1 固氮斯氏假单胞菌dctP-lacZ融合基因的构建  56-60
    4.2.2 dctP-lacZ融合基因表达载体的接合转移  60-61
    4.2.3 固氮斯氏假单胞菌dctP基因的诱导表达  61-62
  4.3 讨论  62-64
结论  64-65
附录  65-80
  附录1 水稻联合固氮工程菌在盐碱稻区应用效果研究  65-73
    1.1 试验材料与方法  65-66
    1.2 试验结果与分析  66-72
      1.2.1 不同处理对水稻株高及分蘖的影响  66-67
      1.2.2 不同处理对水稻根系活力的影响  67-68
      1.2.3 不同处理对水稻生物量的影响  68-69
      1.2.4 不同处理对水稻粗蛋白含量的影响  69-70
      1.2.5 不同处理对水稻产量及产量构成因素的影响  70
      1.2.6 固氮菌对土壤改良的效果  70-72
    1.3 讨论  72-73
  附录2  73-80
参考文献  80-88
发表文章  88-89
致谢  89

斯氏假单胞菌高效固氮工程菌株的构建及其与高光合水稻互作的研究

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