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复合微生物肥料有效菌株的筛选及代表菌株的分子标记

作　者: 蒋宝贵
导　师: 赵斌
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 微生物肥料解磷细菌解钾细菌自生固氮菌
分类号: S144
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

过量的施用化学肥料，对维持生态平衡和保护环境不利，微生物肥料具有长效、无毒、无污染、节约能源、成本低等特点，可弥补化学肥料的缺点和不足。开发和利用微生物肥料的一个关键问题是继续寻找具有高效固氮、解磷、解钾等为作物提供大量或微量元素或对作物具有促生功能的菌株。本实验以解磷、解钾和自生固氮细菌为研究目标，从华中农业大学校园内的土壤样品中分离和筛选到解磷细菌9株、解钾细菌5株和自生固氮细菌4株，将初筛得到的解磷细菌用只含有难溶磷矿粉的基本培养基摇瓶培养，然后用钼锑抗比色法测速效磷含量，结果显示供试的解磷菌株中菌株PJ07和PJ06的可溶性磷浓度分别达到4.7me/kg和3.7me/kg，比对照（2.4mg／kg）增加95.8％和54.1％，大豆盆栽结果显示，接种菌株PJ07的处理比不接种的对照生物量增加43.7％和40.2％，经统计学分析差异达到显著水平（P＜0.05）。将初筛得到的解钾细菌接种到只含有钾长石矿粉的基本培养基摇瓶培养，用原子吸收法测速效钾含量，结果显示供试的5个菌株中速效钾浓度分别为55.9mg／kg、45.6mg／kg、43.3mg／kg、42mg／kg、38.8mg／kg，最低的比对照（21.4mg/g）多34.6％，最高的为HZ03，达到55.9mg／kg，比对照多161％，大豆盆栽结果显示，接种HZ03的处理比不接种的对照生物量增加32％，经统计分析差异也达到显著水平（P＜0.05）。将平板初筛得到的自生固氮菌株用气相色谱法测固氮酶活性，得到两个有较高固氮酶活的菌株NY03和NY02，其酶活分别达到0.43和0.39μmol C₂H₄／发酵液（mL）×反应时间（h）。将上述各菌株经过微生物形态学和生理生化鉴定，结果为菌株PJ07属于假单胞菌属（Pseudomonas）；菌株P01为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；菌株HZ03为胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）；菌株NY03为圆褐固氮菌（Azotobacter chrococcum）。实验以这4个菌株为供试菌株，研究了它们的生长曲线、最佳碳源、最佳氮源、最佳碳氮比、最适初始pH、液体发酵最佳接种量、以及固体发酵生长情况和堆肥试验等常规发酵特征，以期在生产中具有指导作用。结果显示，菌株PJ07生长迅速，第6h即进入对数生长期，第30h活菌数达到10⁹个／mL，其最佳碳源为葡萄糖或蔗糖，最佳氮源为NH₄Cl，最佳C／N介于20～25之间，最佳接种量6％；菌株P01和NY03对数生长期在9h～27h之间，最大活菌数109个／mL，最佳碳源分别为淀粉和蔗糖，最佳氮源均为NH₄NO₃，最佳C／N均为20，最佳接种量均为3％；菌株HZ03生长较为缓慢，对数期介于15h～27h之间，对数期短暂，稀释平板计数显示最大活菌数只能达到10⁷个／mL，最佳碳源和氮源分别为淀粉和NH₄Cl，最佳C／N为25，最佳接种量6％；各菌株最适初始pH均为7，在以麸皮和草糠为基质的固体培养基上，无论单独接种还是混合接种，生长情况良好，没有出现相互抑制的现象，最大活菌数在2d内都能达到10¹⁰个/g。为了能够观察菌株在土壤中的定殖与分布情况，试验对菌株PJ07成功进行了绿色荧光蛋白基因（睁）和发光酶基因（l讼月B）的基因标记，但遗憾的是未能得到稳定的遗传。在上述实验结果的基础上，将各菌株经斜面培养、摇瓶培养、固体发酵制成复合菌剂，经2种不同的方法应用到盆栽中去，其一接种到堆肥基质再施用到土壤，种植油菜;其二直接接种到土壤，种植番茄和玉米;记载植株总生物量。结果显示，油菜盆栽比对照增加64%，番茄盆栽比对照增加82%，玉米盆栽比对照增加1倍，统计分析表明差异达到显著水平（P<0 .05），在玉米盆栽中，除了对照外还设了三种市售的微生物肥料作比较，这三种微生物肥料分别来自北京、上海、河北，结果显示接种这三种肥料的处理分别比对照增加85%、6%、n%，本试验的复合菌剂肥效优于其它的生物肥。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
1 文献综述  8-17
  1.1 发展微生物肥料的目的与意义  8
  1.2 微生物肥料的含义和特点  8-9
  1.3 微生物肥料的类型和作用机理  9-16
    1.3.1 微生物肥料的类型  9-10
    1.3.2 微生物肥料的作用机理  10-16
  1.4 微生物肥料的开发利用现状  16
  1.5 本研究的主要内容  16-17
2 材料与方法  17-29
  2.1 试验材料  17-20
    2.1.1 供试土样  17
    2.1.2 供试植物品种  17
    2.1.3 供试菌株及质粒  17
    2.1.4 培养基、培养条件、试剂及抗生素  17-20
      2.1.4.1 培养基  17-19
      2.1.4.2 培养条件  19
      2.1.4.3 试剂  19-20
      2.1.4.4 抗生素  20
  2.2 试验方法  20-29
    2.2.1 细菌的分离筛选  20-21
      2.2.1.1 解磷细菌的分离筛选  20
      2.2.1.2 解钾细菌的分离筛选  20
      2.2.1.3 自生固氮菌的分离筛选  20-21
    2.2.2 细菌的鉴定  21-24
      2.2.2.1 菌落形态的观察  21
      2.2.2.2 革兰氏染色与菌体形态的观察  21
      2.2.2.3 生理生化实验  21-24
    2.2.3 代表菌株一般发酵条件的研究  24-25
      2.2.3.1 各菌株生长曲线的测定  24
      2.2.3.2 液体发酵最佳碳源实验  24
      2.2.3.3 液体发酵最佳氮源试验  24
      2.2.3.4 液体发酵不同C／N比对菌量的影响  24
      2.2.3.5 液体发酵最佳初始pH试验  24-25
      2.2.3.6 液体发酵最佳接种量试验  25
      2.2.3.7 单菌株固体发酵和多菌株混合固体发酵最大活菌数的测定  25
      2.2.3.8 堆肥发酵试验  25
    2.2.4 代表菌株PJ07的发光酶基因的分子标记  25-27
      2.2.4.1 解磷细菌PJ07的GFP标记  25-27
      2.2.4.2 解磷细菌PJ07的LuxAB基因标记  27
      2.2.4.3 基因gfp和LuxAB稳定性检测  27
    2.2.5 盆栽试验确定优化组合  27-29
      2.2.5.1 最佳解磷细菌和最佳解钾细菌的盆栽筛选  27
      2.2.5.2 最佳解磷解钾自生固氮菌及其组合在番茄中的盆栽试验  27-28
      2.2.5.3 最佳解磷解钾自生固氮细菌及其组合的堆肥并用于油菜盆栽的试验  28
      2.2.5.4 复合菌剂在非灭菌土壤中的玉米盆栽试验  28-29
3 结果与分析  29-46
  3.1 解磷细菌的筛选结果  29
  3.2 解钾细菌的筛选结果  29-30
  3.3 自生固氮菌的筛选结果  30-31
  3.4 菌株的鉴定结果  31-34
  3.5 菌株P01、PJ07、HZ03、NY03发酵条件的研究  34-39
    3.5.1 菌株P01、PJ07、HZ03、NY03的生长曲线  34
    3.5.2 各菌株的最佳碳源  34-36
    3.5.3 最佳氮源  36
    3.5.4 最佳碳氮比  36-37
    3.5.5 最适初始pH  37-38
    3.5.6 最佳接种量  38
    3.5.7 固体发酵  38-39
  3.6 菌株PJ07的GFP标记和LusAB标记  39-40
    3.6.1 GFP标记  39-40
    3.6.2 LuxAB标记  40
    3.6.3 标记菌株的质粒稳定性检测  40
  3.7 盆栽结果  40-46
    3.7.1 解磷细菌和解钾细菌的盆栽筛选结果  40-42
    3.7.2 代表性菌株及其组合在番茄盆栽试验中的效果  42-43
    3.7.3 复合菌剂在有机质的堆肥试验及堆肥后基质在油菜盆栽试验中的效果  43-44
    3.7.4 复合菌剂在非灭菌土壤中的玉米盆栽试验效果  44-46
4 讨论  46-49
  4.1 微生物肥料的肥效  46
  4.2 微生物肥料的发展趋势  46-47
  4.3 微生物肥料今后的研究方向  47-49
参考文献  49-52
致谢  52-53
附录  53-57

复合微生物肥料有效菌株的筛选及代表菌株的分子标记

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