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利用分枝杆菌降解植物甾醇生产雄甾烯酮的研究

作　者: 王风清
导　师: 路福平
学　校: 天津科技大学
专　业: 发酵工程
关键词: 分枝杆菌侧链降解植物留醇雄甾-4-烯-3 17-二酮雄甾-1 4-二烯-3
分类号: TQ464
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

本实验利用分枝杆菌M1与M2切除植物甾醇C₁₇位边链，制备ADD与AD，主要研究内容包括以下几个方面： 1．分析测定方法的建立：薄层层析法，以乙酸乙酯:石油醚（6:4）作为展层剂，以硅胶作为固定相，主要用于定性分析底物与产物；紫外吸光光度法，采用双波长（254nm与298nm）检测，主要用于快速定量分析ADD与AD；根据高效液相色谱与薄层层析相同的工作原理，采用硅胶柱，在薄层层析分析法基础上建立了高效液相色谱法，同时建立了两种定量测定方法：标准曲线法与内标法，高效液相色谱法主要用于准确定量测定产物ADD与AD；气相色谱法，采用FID检测器和大口径毛细管柱，主要用于分析底物甾醇，根据FID的工作原理，确定了各物质的相对校正因子，气相色谱法可用于定量分析底物的四种成份和产物AD（D）在发酵液中的相对含量。 2．生产菌种的性质：实验中发现菌体在培养过程中随着营养物质的消耗，细胞形态发生有规律的变化，从长杆状逐渐变为短杆状，最后变为球形；这种形态分化与菌体降解甾醇的活性有一定相关性：当菌体为长杆状时转化活性很高；当菌体变为短杆状时转化活性明显下降；菌体变为球形时转化活力基本消失。两株实验菌M1与M2在菌体形态上没有区别，但在生产能力上有较大差别，根据菌株对底物转化能力的大小，选择M2作为主要研究对象。 3．工艺参数的确定：详细研究了一级转化法与二级转化法两种工艺。一级转化法中：斜面种子用MYC/S2培养基29℃恒温培养60h，冷冻保藏不超过20d，转接发酵培养基MYC/02的接种量为7％；二级转化法中：液体种子的接种种龄为35h～40h，以7％的接种量接种发酵培养基MYC/02，并优化了发酵培养基的培养条件：pH=7.0、温度29℃、保证充足的溶氧。 4．投料的方式：通过对乙醇法、Tween80法、环糊精法及超声波法等的试验，确定以Tween80乳化底物的投料方式，即用0.5％～1.0％的Tween80悬浮甾醇，在120℃高温中乳化，然后用于配制发酵培养基MYC/02。 5．5L发酵罐转化工艺优化：在摇瓶实验的基础上，进行了5L罐扩大培养实验，在培养过程中保持转化温度为29℃，流加10％NaOH与2M盐酸控制pH为7.0，通过调节空气流量与搅拌转速保持充足的供氧。5L罐转化结果（转化168h）：①投料量为0.3％，底物转化率为100％，AD（D）产率为90％以上；②投料量为0.5％，底物转化率为95％左右，AD（D）产率为85％左右；③投料量为1.0％，底物转化率为50％～60％，产物生成率在50％左右。

全文目录

第一章前言  9-26
  1.1 甾体化合物的结构、分类与临床应用  9-10
  1.2 甾体医药工业发展简史  10-13
    1.2.1 甾体药物研究发展史  10-12
    1.2.2 甾体药物生产原料的发展  12-13
  1.3 甾体化合物的微生物转化  13-18
    1.3.1 甾体化合物微生物转化反应类型  13-14
    1.3.2 甾体微生物转化反应的共性难题  14-17
    1.3.3 反应的转化工艺  17-18
  1.4 侧链降解生产雄甾烯酮的意义、途径和机理  18-21
    1.4.1 雄甾烯酮ADD与AD的作用意义  18-19
    1.4.2 微生物选择性降解甾体边链的机理  19-20
    1.4.3 微生物对甾体母核的降解机理  20-21
  1.5 本课题的立题依据  21-25
    1.5.1 国内外甾体医药工业的现状  21-22
    1.5.2 国内外技术水平分析  22-23
    1.5.3 国内外市场现状和发展趋势  23
    1.5.4 植物甾醇的来源  23-25
  1.6 本论文的研究内容  25-26
第二章材料与方法  26-32
  2.1 实验材料  26-28
    2.1.1 实验菌种  26
    2.1.2 实验试剂  26
    2.1.3 实验仪器  26-27
    2.1.4 培养基  27-28
  2.2 实验方法  28-32
    2.2.1 样品处理与分析方法  28-29
    2.2.2 发酵工艺流程  29-30
    2.2.3 投料方法  30
    2.2.4 其它测定法  30-32
第三章结果与讨论  32-61
  3.1 分析方法的建立  32-42
    3.1.1 底物与产物的特征吸收峰检测  32-33
    3.1.2 薄板层析方法  33-34
    3.1.3 紫外吸收光谱法  34-35
    3.1.4 高效液相色谱法  35-38
    3.1.5 气相色谱法  38-40
    3.1.6 转化效果的评价方法  40-42
  3.2 菌种的性质  42-47
    3.2.1 菌种的鉴定  42-44
    3.2.2 菌体的转化活性及目的菌的选择  44-45
    3.2.3 菌株的生产能力  45-47
  3.3 生产工艺路线的选择  47-50
    3.3.1 斜面种子的活性及斜面培养基的改进  47-48
    3.3.2 三种工艺路线的比较及工艺参数的确定  48-50
  3.4 转化条件的优化  50-51
    3.4.1 温度对转化的影响  50
    3.4.2 pH对转化的影响  50-51
    3.4.3 通风量对转化的影响  51
  3.5 底物投料方式对转化的影响  51-57
    3.5.1 有机溶媒法  51-53
    3.5.2 Tween80法  53-54
    3.5.3 环糊精法包埋法  54-55
    3.5.4 超声波法  55
    3.5.5 原料对转化的影响  55-56
    3.5.6 底物浓度对转化的影响  56-57
  3.6 小试  57-60
    3.6.1 菌体在5L罐内的生长曲线与葡萄糖消耗曲线  57-58
    3.6.2 操作参数的控制  58
    3.6.3 产物的生成  58
    3.6.4 不同投料浓度的转化情况  58-59
    3.6.5 底物中不同组分的转化情况  59-60
  3.7 其它  60-61
    3.7.1 提取  60
    3.7.2 色素  60-61
第四章结论  61-63
第五章展望  63-65
  5.1 菌种的改良  63
  5.2 提取方法的研究  63
  5.3 提高转化体系转化能力的进一步研究  63-64
    5.3.1 改进培养基和培养方式  63
    5.3.2 投料新方法的研究  63
    5.3.3 增加细胞膜的透性  63-64
  5.4 基因工程菌的构建  64-65
致谢  65-66
参考文献  66-71
论文发表情况  71-72
附录1 产物ADD与AD  72
附录2 底物的四种组份  72
附录3 原料  72-73

利用分枝杆菌降解植物甾醇生产雄甾烯酮的研究

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