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用野油菜黄单胞菌插入突变体库筛选与胞外蛋白酶产生相关的基因

作　者: 韦梅良
导　师: 唐纪良；何勇强
学　校: 广西大学
专　业: 微生物学
关键词: 野油菜黄单胞菌 转座子诱变 胞外蛋白酶 缺失突变体 TAIL-PCR
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


用转座子Tn5gusA5诱变野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv.campestris以下简称Xcc），构建了Xcc8004Tn5gusA5插入突变体库。获得Tn5gusA5插入突变体17820个，从中筛选胞外蛋白酶突变体。经含1％牛乳的NYGA平板检测，获得水解圈明显减小的突变体53个。运用TAIL-POR和测序的方法定位了转座子Tn5gusA5的插入位置，经分析共插入14个ORF中。ORF注释表明，共中一个基因为胞外蛋白酶结构基因，3个基因与合成调控有关，5个与转运分泌有关，2个与LPS合成有关，其余3个ORF的注释功能与胞外蛋白酶的关系未见报道，为研究这3个ORF与胞外蛋白酶产生的关系，采用同源双交换ORF缺失法进行了进一步验证，成功地构建了xcc4463缺失突变体，所得缺失突变体经检测胞外蛋白酶减少，在寄主上致病性降低。

全文目录


中文摘要  5-6
英文摘要  6-7
第一章 前言  7-21
  1．1 野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv．campestris）分子遗传学研究进展  7-9
    1．1．1 野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv．campestris）概述  7
    1．1．2 Xcc分子遗传学研究进展  7-9
  1．2 胞外酶研究进展  9-15
    1．2．1 细菌细胞壁结构与胞外酶  9-10
    1．2．2 胞外酶合成的调控  10-12
    1．2．3 胞外酶的分泌  12-14
    1．2．4 植物病原菌胞外酶在致病性中的作用  14-15
  1．3 XccTn5gusA5插入突变体库的构建  15-16
    1．3．1 转座子诱变在分子遗传研究中的应用  15-16
    1．3．2 构建XccTn5gusA5突变体库  16
  1．4 TAIL-PCR技术应用于Tn5gusA5在Xcc基因组上的定位  16-20
  1．5 本研究工作的目的、内容及意义  20-21
    1．5．1 目的与内容  20
    1．5．2 意义  20-21
第二章 材料与方法  21-31
  2．1 材料  21-23
    2．1．1 本实验所用菌株和质粒  21
    2．1．2 培养基及生长条件  21-22
    2．1．3 抗菌素及其贮存，使用浓度  22
    2．1．4 溶液与缓冲液  22-23
  2．2 方法  23-31
    2．2．1 三亲本接合和两亲本接合  23-24
    2．2．2 胞外蛋白酶的检测  24-25
    2．2．3 PCR反应  25-27
    2．2．4 琼脂糖凝胶电泳  27
    2．2．5 质粒的提取  27-28
    2．2．6 限制性内切酶酶切  28
    2．2．7 DNA连接  28
    2．2．8 感受态细胞的制备  28-29
    2．2．9 转化  29
    2．2．10 总DNA的提取  29
    2．2．11 植株的致病性试验  29
    2．2．12 生长曲线的测定  29-31
第三章 结果与分析  31-48
  3．1 Xcc Tn5gusA5突变体库  31
  3．2 胞外酶突变体的筛选  31-32
  3．3 胞外酶突变体中Tn5gusA5在Xcc8004基因组上插入的定位  32-33
  3．4 胞外酶突变体中Tn5gusA5在Xcc8004基因组上的定位的结果  33-34
  3．5 xcc_4463的缺失验证  34-41
    3．5．1 xcc_4463插入突变体Tn5gusA5的插入位置  34
    3．5．2 xcc_4463缺失突变体的构建  34-41
  3．6 xcc_4463缺失突变体的胞外酶检测和致病性试验  41-43
    3．6．1 xcc_4463缺失突变体的胞外酶检测  42
    3．6．2 xcc_4463缺失突变体的致病性试验  42-43
  3．7 xcc_4463缺失突变体及插入突变体的生长曲线  43-46
  3．8 xcc_4463推测蛋白的同源比较  46-48
第四章 讨论  48-51
  4．1 关于Xcc突变体库的构建  48
  4．2 胞外酶产生相关的基因  48-49
  4．3 xcc_4463与胞外酶的关系  49-51
参考文献  51-58
致谢  58

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