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微RNAlet-7d抑制胶质瘤生长和侵袭

作　者: 程子昊
导　师: 刘宁
学　校: 南京医科大学
专　业: 神经外科
关键词: 胶质瘤微RNA let-7d 侵袭 Ras
分类号: R739.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

【背景与目的】人脑胶质瘤是颅内最常见的原发肿瘤，其中恶性胶质瘤约占60%。恶性胶质瘤是人类最恶性、最具侵袭性的肿瘤之一，尽管先进的技术已经做为常规方法应用于治疗胶质瘤病人，但远期生存率仍不能令人满意。所以近年来，很多研究都着重于寻求用分子生物学的方法对胶质瘤进行治疗以及对预后做出评估。MiRNA是一类平均长度为22bp的非编码小RNA，它通过和靶基因3’端非翻译区种子序列完全或不完全互补结合的形式来发挥其转录后水平的基因表达调控作用。通过调控基因的表达，miRNA在生物的生命过程中起着非常重要的作用，广泛参与机体生长、发育、疾病发生等各种生命过程。近年来从多种生物体中已经鉴定出了一千多种miRNAs，但只有少数miRNAs的功能及靶基因被研究清楚，大部分miRNAs在细胞中所起的作用对我们来说还是一个有待揭示的谜。作为一种可调控基因表达的内源性分子，miRNA在肿瘤的基因治疗中也具有许多独特的优势，因而受到越来越多研究者的重视。在前期的工作中，我们用含有所有人类已知的miRNAs的芯片，借助于我科丰富的人脑胶质瘤标本库，研究人类WHO各种组织病理分型的胶质瘤和正常脑组织中miRNAs的表达谱，找出脑胶质瘤中特异性表达的miRNAs，let-7d就是其中之一。Let-7d是let-7家族成员之一，已被证明与白血病细胞的增殖分化有关。本研究着重探讨let-7d在人脑胶质瘤组织和正常人胶质组织中表达上的差异，在此基础上，通过调节let-7d在胶质瘤细胞中的表达，观察其对人脑胶质瘤U87细胞生物学特征的影响，从而推测其在胶质瘤发生发展中的作用。【方法】首先用原位杂交法检测let-7d在人脑胶质瘤组织和正常脑组织中表达，胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性，阳性染色越多，说明表达量越高。然后以脂质体为载体，和let-7d寡核苷酸按各比例混合转染U87细胞，测定转染效率，以最适比例转染细胞，培养一定时间后，利用MTT法通过比较酶标仪550nm波长各孔吸光光度值来观察各组细胞生长的差异，Hoechst染色在光镜下观察各组细胞核形态的改变，Annexin V-EGFP/PI染色后流式细胞仪检测早期细胞凋亡率，Transwell试验在光镜下计数通过Transwell小孔到下室的细胞数，从而检测各组细胞的侵袭能力。再确定let-7d寡核苷酸在胶质瘤中的作用后，我们又用Western Blot方法分析ras蛋白表达，以探讨let-7d寡核苷酸是通过何种下游靶基因发挥生物学作用。【结果】通过原位杂交染色，显微镜下观察各组细胞阳性染色情况，发现正常脑组织胶质细胞中有较强的表达信号，而在胶质瘤组织中表达很弱。然后通过测定转染效率，我们发现脂质体和let-7d寡核苷酸按质量比4：1混合转染U87细胞，效率较高，且细胞毒性最小。随后在MTT实验中，我们发现转入let-7d寡核苷酸的U87细胞，生长显著减缓，且在转染48h后对细胞生长的抑制最明显；Hochest染色观察实验组细胞的细胞核染色质浓集、断裂成块，胞核呈亮蓝色荧光，而对照组细胞核呈均匀淡蓝紫色，细胞核形态完整，罕见凋亡细胞；Annexin V-EGFP/PI染色发现早期凋亡细胞明显增多，占14.22%，而对照组早期凋亡细胞较少，占5.85%，两组间有统计学差异；侵袭实验发现实验组通过Transwell小孔的细胞数明显减少，随即观察7个视野，发现实验组细胞运动至Transwell小室下室的数目较对照组明显减少，且有统计学意义。通过Western Blot检测，我们发现实验组的Ras表达量较对照组和空白组明显下降，这也表明let-7d可能是通过负调控Ras蛋白的表达起作用的。【结论】微RNAlet-7d在胶质瘤的发生发展中可能起抑制作用，并很可能通过其下游的Ras蛋白发挥生物学作用。Let-7d可成为胶质瘤基因治疗的侯选靶点，反义miRNA寡聚核昔酸转染技术是一项有效的基因沉默技术，具有临床应用前景。

全文目录

一、中文摘要  4-7
二、英文摘要  7-10
三、前言  10-14
四、材料与方法  14-24
五、实验结果  24-31
六、讨论  31-36
七、参考文献  36-40
八、攻读学位期间发表论文情况  40-41
九、综述  41-56
  参考文献  51-56
十、致谢  56

微RNAlet-7d抑制胶质瘤生长和侵袭

内容摘要

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