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甲醛对类香草素受体的激活作用和甲醛诱导型哮喘分子机理的研究

作　者: 严彦
导　师: 杨旭
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学及分子生物学
关键词: 香草素分子机理甲醛激活作用诱导型靶分子哮喘刺激作用假说细胞模型
分类号: R562.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

近年来,关于室内空气甲醛污染与人体健康效应的研究日益广泛深入。甲醛引起的气道神经源性炎症、获得性过敏体质现象等生物学效应,都涉及甲醛触发性生物靶分子介导的病理学过程。1991年丹麦学者G.D.Nielsen首先提出假说:室内空气污染物(如甲醛)所致的气道刺激作用是一种受体介导的病理学过程,这种受体可能是辣椒素受体,现已证实辣椒素受体即为类香草素受体,它们分布于气道黏膜中神经末梢的细胞膜上。由于当时和后来对这种膜受体蛋白本质的认识还非常有限,他所提出的假说一直没有得到科学实验的证实。1997年美国加洲大学David Julius教授课题组首次鉴定并命名了类香草素受体(vanilloid receptor subtype 1,VR1),他们构建了大鼠感觉神经元VR1重组质粒,并成功地在人胚肾细胞(HEK-293细胞)和非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus laevis oocyte)中表达出VR1膜蛋白/离子通道,建立了VR1~+重组细胞,进行了有关VR1的分子生物学、电生理学研究,并应用于疼痛传导机制和分子药理学的研究,其多篇研究论文在《Nature》和《Science))上发表。VR1~+重组细胞的建立为检验和完善Nielsen假说提供了坚实的物质基础。我们将该受体的研究引入环境医学领域,很可能导致对室内空气污染与疾病关系分子机理的研究(如甲醛诱导型哮喘)取得重要进展。本课题就甲醛对VR1的激活作用开展了体外和体内实验研究,阐明甲醛触发性生物靶分子的作用机理,验证Nielsen假说的正确性;在此基础上开展了甲醛诱导型哮喘分子机理的实验研究,结果如下: 1.VR1~+-HEK293细胞模型的构建和Nielsen假说的验证为研究VR1作为室内空气污染物的触发性生物靶分子的生理作用,在VR1-cDNA质粒基础上,应用分子克隆和细胞转染技术构建了体外培养的VR1~+-HEK293细胞模型,并应用此细胞模型进行辣椒素和甲醛致VR1~+-HEK293细胞死亡实验。结果表明,VR1~+-HEK293细胞模型构建成功,VR1~+细胞死亡实验是一种简便有效的鉴定VR1体外表达的实验方法;甲醛能够激活VR1,且激活反应能被VR1特异性拮抗剂capsazepine所阻断,从而推断甲醛对气道的刺激作用也可能是通过VR1所介导的。用体外细胞学实验证实了VR1是甲醛作用的生物靶分子,以实验证实了Nielsen假说的正确性。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-15
一．文献综述  15-26
  1．VR1~+-HEK293细胞模型的构建和Nielsen假说的验证  15-17
    1．1 环境医学悬案——Nielsen假说  15-16
    1．2 类香草素受体(辣椒素受体)  16-17
    1．3 VR1~+细胞模型构建的意义  17
  2．非洲爪蟾卵母细胞电压钳实验  17-19
    2．1 非洲爪蟾卵母细胞生物学特性  17-18
    2．2 研究方案和技术路线  18
    2．3 用分子药理学实验手段解决环境医学问题  18-19
  3．非致炎浓度的福尔马林激活小鼠皮肤类香草素受体  19-20
    3．1 理想的疼痛学动物模型——小鼠福尔马林痛觉模型  19
    3．2 类香草素受体(VR1)在痛觉传导中的重要作用  19-20
  4．获得性过敏体质：甲醛诱导型哮喘一种可能的发病机理  20-23
    4．1 传统的过敏性哮喘发病机理学说  20-21
    4．2 一个重要的环境医学基础理论问题  21
    4．3 一种可以依靠的模型化合物——甲醛  21-22
    4．4 过敏体质激发原与获得性过敏体质假说  22
    4．5 第二套VR1信号传递系统  22
    4．6 非过敏原性空气污染物诱发哮喘的分子机理  22-23
  5．亚硝基谷胱甘肽还原酶：甲醛诱导型哮喘一种新的可能的发病机理  23-26
    5．1 甲醛激活GSNOR并影响气道中NO与GSNO的平衡和哮喘发生  23-24
    5．2 GSNOR调控的NO与GSNO的平衡  24
    5．3 我们的假说  24-26
二．材料与方法  26-32
  1．实验材料  26-28
    1．1 BLAB／c小鼠和KM小鼠  26
    1．2 DH5a大肠杆菌  26
    1．3 人胚肾细胞系HEK293细胞  26
    1．4 非洲爪蟾卵母细胞  26
    1．5 主要试剂  26
    1．6 主要溶液  26-27
    1．7 主要仪器  27-28
  2．实验方法  28-32
    2．1 VR1~+-HEK293细胞模型的构建和Nielsen假说的验证  28-29
    2．2 非洲爪蟾卵母细胞电压钳实验  29-30
    2．3 非致炎浓度福尔马林激活小鼠皮肤类香草素受体实验  30-31
    2．4 甲醛诱导获得性过敏体质小鼠肺泡灌洗液IL-4和血清总IgE的检测  31
    2．5 RT-PCR法检测气态甲醛调节小鼠肺组织GSNOR的转录水平  31
    2．6 统计分析  31-32
三．实验结果  32-47
  1．VR1~+-HEK293细胞模型的构建和Nielsen假说的验证  32-36
    1．1 VR1-pcDNA3质粒转化、扩增、酶切鉴定结果  32-33
    1．2 不同浓度CAP对正常HEK293细胞存活的影响  33-34
    1．3 CAP致VR1表达细胞死亡实验  34-35
    1．4 FA致VR1表达细胞死亡实验结果  35-36
  2．非洲爪蟾卵母细胞电压钳实验  36-39
    2．1 卵母细胞标本的制备  36-37
    2．2 非洲爪蟾卵母细胞内源性ATP激活电流  37-39
  3．非致炎浓度的福尔马林激活小鼠皮肤类香草素受体  39-42
    3．1 不同浓度福尔马林致小鼠疼痛反应实验结果  39-40
    3．2 不同浓度辣椒素(CAP)致小鼠疼痛反应实验结果  40-41
    3．3 CPZ抗CAP致痛作用的实验结果  41
    3．4 CPZ抗FM致痛作用的实验结果  41-42
  4．获得性过敏体质：甲醛诱导型哮喘一种可能的发病机理  42-45
    4．1 气态甲醛染毒浓度的测定结果  43
    4．2 小鼠肺泡灌洗液IL-4检测结果  43-44
    4．3 小鼠血清总IgE检测结果  44-45
  5．亚硝基谷胱甘肽还原酶：甲醛诱导型哮喘一种新的可能的发病机理  45-47
    5．1 RT-PCR法检测气态甲醛调节GSNOR的转录水平(预实验)  45-46
    5．2 小鼠肺组织中一氧化氮合酶(NOS)活力水平的检测  46
    5．3 小鼠肺组织中一氧化氮(NO)的检测  46-47
四．讨论  47-55
  1． VR1~+-HEK293细胞模型的构建和Nielsen假说的验证  47-48
    1．1 CAP致VR1表达细胞死亡的特性  47
    1．2 检测VR1表达的新方案  47-48
    1．3 对Nielsen假说的验证  48
    1．4 与电压钳实验的印证  48
  2．非洲爪蟾卵母细胞电压钳实验  48-50
    2．1 电压钳实验的意义  48-49
    2．2 非洲爪蟾卵母细胞内源性ATP激活电流实验  49
    2．3 下一步实验计划  49-50
  3．非致炎浓度福尔马林激活小鼠皮肤类香草素受体  50-52
    3．1 福尔马林的最适致痛剂量  50
    3．2 伤害性感受器拮抗剂的有效浓度  50
    3．3 福尔马林所致疼痛的外周传导机制  50-51
    3．4 Nielsen假说的验证  51
    3．5 甲醛与VR1  51
    3．6 不同浓度福尔马林的致痛机理  51-52
  4．获得性过敏体质：甲醛诱导型哮喘一种可能的发病机理  52-53
    4．1 第二套类香草素受体信号传递系统  52-53
    4．2 甲醛诱导型哮喘发病机理的探讨  53
  5．亚硝基谷胱甘肽还原酶：甲醛诱导型哮喘一种新的可能的发病机理  53-55
    5．1 气道中的NO和GSNO对气道的联合调节作用  53-54
    5．2 有益的理论探索  54-55
五．结论  55-56
六．参考文献  56-59
主要英文缩写词  59-60
附录  60-82
  硕士在读期间学术成果  60-64
  分子生物学和电压钳实验操作  64-77
  标准气态甲醛动态染毒装置  77-79
  声学传感器法小鼠哮喘模型体征监测装置  79-82
致谢  82-84

甲醛对类香草素受体的激活作用和甲醛诱导型哮喘分子机理的研究

内容摘要

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