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PCR法进行小鼠和牛的性别鉴定

作　者: 王晗
导　师: 窦忠英
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 小鼠牛 SRY 基因 ZFY-ZFX基因 PCR
分类号: S814.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

家畜胚胎的性别鉴定是胚胎移植的重要组成部分。通过移植已知性别的胚胎,可使家畜达到理想的性别比例,这在畜牧业生产上具有重要的意义。动物的某些生产性状是受性别限制（泌乳等）或性别影响的（产肉、产毛等）,通过性别控制可以使这些性状在更多的理想性别中获得更大的经济效益,加快优良母畜的繁殖速度,促进高效畜牧业的发展。如在养牛业上,结合胚胎分割、胚胎冷冻保存等动物繁殖技术,可以选育优良母牛,增加牛奶产量,提高肉牛产肉率。本研究以小鼠和牛为研究对象,分别建立了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）鉴定小鼠和牛性别的方法,并讨论了影响PCR 扩增的几个因素。主要内容有以下几点: （1）　依据小鼠和牛SRY 基因序列,分别设计合成其巢式PCR 引物;同时根据小鼠和牛ZFY-ZFX基因的序列,设计合成其各自的内对照引物。（2）　分别采集雌雄小鼠和公母牛少量组织样品,试剂盒抽提基因组DNA,保存于TE溶液中,作为反应模板,进行PCR 扩增,其性别鉴定结果与已知性别完全一致。（3）　超排处理母鼠,分别收集2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎和早期桑椹胚,视为微量细胞样品,热处理后进行PCR 扩增。比较常规和巢式、复合式PCR 方法,并对Mg²⁺浓度进行梯度选择（1.5、2.5、3.0 mmol/L）,确立了合适的扩增体系及反应条件。实验结果显示,在扩增微量样品时,巢式PCR 胚胎可鉴别率（94.1%,111/118）高于常规PCR（64.3%,36/56）,复合式PCR 则更有利于排除假阴性结果的干扰,而2.5 mmol/L 的Mg²⁺浓度扩增效果较好。（4）　超排处理母鼠,收集致密桑椹胚和囊胚,进行活检。采用简易切割法,将致密桑椹胚切为一大一小两部分,囊胚则切取少量滋养层细胞。胚胎主体进行染色体分析,其鉴定结果作为性别标准。半胚或取样细胞相应编号,热处理后进行PCR鉴定。实验结果为:通过核型分析法,共鉴定21 枚胚胎,12 枚为雄性,9 枚为雌性;?b通过PCR 法鉴定,其中12 枚胚胎判为雄性,8 枚判为雌性,与核型分析结果一致,1 枚为假阳性结果;PCR 鉴定的准确率为95.2%（20/21）。（5）　收集已知性别的公母牛微量细胞样品。在高倍实体显微镜下分别取5-10 枚细胞,热处理后进行PCR 扩增,确立合适的扩增体系及反应条件。（6）　对牛精液、血清、操作液及操作者头屑等可能对鉴定造成影响的几个因素进行了研究和检测,PCR 扩增结果表明,这些因素不会对PCR 鉴定造成污染。

全文目录

文献综述  11-33
  前言  11
  第一章性别决定机理  11-19
    1.1 染色体决定论  11-12
    1.2 睾丸决定因子  12
    1.3 雄性特异性弱组织相容性抗原  12
    1.4 锌指结构基因  12-13
    1.5 性别决定基因  13
    1.6 其它与性别决定相关的基因  13-16
      1.6.1 DSS和DAX-1基因  13-14
      1.6.2 SOX9基因  14
      1.6.3 MIS/mis基因  14-15
      1.6.4 SF-1因子  15
      1.6.5 WT-l基因  15-16
    1.7 性别决定假说及其它分子模型  16-19
      1.7.1 SRY基因性别决定的假说  16
      1.7.2 Z-基因模型  16
      1.7.3 DSS-基因模型  16
      1.7.4 Jimenez模型  16-17
      1.7.5 Jennifer模型  17-19
  第二章性别控制方法  19-25
    前言  19
    2.1 X、Y精子的分离  19-21
      2.1.1 沉降法  19
      2.1.2 密度梯度离心法  19
      2.1.3 电泳法  19-20
      2.1.4 F-body识别法  20
      2.1.5 免疫法  20
      2.1.6 白蛋白柱分离法  20
      2.1.7 流式细胞分离法  20-21
    2.2 胚胎性别鉴定  21-25
      2.2.1 细胞遗传学方法——核型分析  21-22
      2.2.2 生物化学方法——X-连接酶测定  22
      2.2.3 免疫学方法——H-Y抗原法  22-23
      2.2.4 分子生物学方法  23-25
  第三章 PCR法早期胚胎性别鉴定  25-31
    3.1 PCR扩增法的基本原理  25
    3.2 PCR扩增法的鉴定程序及优点  25-26
    3.3 PCR法进行早期胚胎性别鉴定技术的进展  26-30
      3.3.1 胚胎取样技术的发展  26-28
      3.3.2 引物的选择  28-29
      3.3.3 PCR扩增技术的改进  29-30
      3.3.4 结果检测技术的突破  30
    3.4 国内研究现状及存在问题  30-31
  结束语  31-33
试验研究  33-50
  第四章 PCR法小鼠早期胚胎性别鉴定  33-43
    前言  33
    4.1 材料方法  33-37
      4.1.1 材料  33-34
      4.1.2 方法  34-37
    4.2 结果  37-41
      4.2.1 PCR引物特异性检测  37
      4.2.2 不同Mg~(2+)浓度时微量样品的扩增  37-38
      4.2.3 常规PCR和巢式PCR扩增微量细胞样品  38-39
      4.2.4 常规PCR和复合PCR扩增结果比较  39-40
      4.2.5 核型分析法检验PCR鉴定结果  40-41
    4.3 讨论  41-43
      4.3.1 Mg~(2+)浓度对鉴定结果的影响  41
      4.3.2 取样细胞个数对鉴定结果的影响  41
      4.3.3 巢式PCR具有较高的灵敏性  41
      4.3.4 复合式PCR有利于假阴性结果的排除  41-42
      4.3.5 胚胎切割成功率较低  42
      4.3.6 核型分析法性别鉴定胚胎可鉴定率较低  42
      4.3.7 外源性污染导致鉴定准确性降低  42-43
  第五章 PCR法鉴定牛组织性别  43-49
    前言  43
    5.1 材料方法  43-45
      5.1.1 材料  43-44
      5.1.2 方法  44-45
    5.2 结果  45-46
      5.2.1　PCR 引物特异性检测  45
      5.2.2 巢式 PCR 扩增微量样品  45
      5.2.3 可能造成污染的因素  45-46
    5.3 讨论  46-49
      5.3.1 精子的存在对鉴定结果的影响  46
      5.3.2 犊牛血清对鉴定结果的影响  46-47
      5.3.3 操作者头屑对鉴定结果的影响  47-49
  结论  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-59
作者简介  59

PCR法进行小鼠和牛的性别鉴定

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