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人β地中海贫血β～（41/42）突变基因的克隆和真核表达体系的构建

作　者: 唐晖
导　师: 李弘剑
学　校: 暨南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: β地中海贫血 β41/42突变基因 基因疗法 体外细胞模型
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


背景:β地中海贫血（简称β地贫）是一种具有高度异质性的遗传疾病。由于β珠蛋白基因突变,造成α珠蛋白肽链和β珠蛋白肽链间的合成失平衡是其主要发病机制。在东南亚,包括我国西南、华南地区,β地贫已成为严重的公共卫生问题,其中β41/42突变是最常见的导致重型β地贫的突变之一。 目的:克隆人地中海贫血基因β41/42及调控系列LCR,构建该致病基因的体外真核表达体系,为该病基因治疗的研究提供理想模型。 方法:抽提β41/42纯合子患者的DNA,PCR扩增出人β珠蛋白基因座控制区（LCR）和β41/42基因,将其串连克隆至真核稳定表达质粒pcDNA3.1（-）中,脂质体转染至小鼠红白血病细胞（MEL）,DMSO诱导MEL细胞表达,逆转录PCR检测人β41/42基因在MEL中的表达。 结果:成功构建了包括长为2.1kb的人β41/42突变基因和长5.5kb的人β珠蛋白基因的远端调控序列（LCR）的真核表达质粒pcDNA3.1-LCR-β41/42,并使其导入MEL细胞,RT-PCR显示β41/42突变基因在MEL细胞中稳定的表达。 结论:成功构建了人β41/42突变基因的LCR/MEL体外细胞模型,该模型真实地模拟了人体内β珠蛋白基因自身的调控形式,为β41/42地贫的基因治疗研究提供了理想模型。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
一 前言  9-17
  1：地中海贫血  9-10
  2：β珠蛋白的基因结构  10-11
  3：MEL细胞  11-12
  4：β地中海贫血的治疗现状  12
  5：β地中海贫血基因治疗  12-17
    5.1 β珠蛋白基因表达调控机制  13-14
    5.2 β地中海贫血基因治疗的策略  14-17
二 实验材料与仪器  17-21
  1：菌株、质粒和细胞  17
  2：主要试剂及培养基的配制  17-20
  3：仪器与设备  20-21
三 技术路线  21-22
四 实验方法  22-38
  1：LCR及β~(41／42)突变基因结构图  22
  2：pcDNA3.1-LCR-β~(41／42)重组质粒的构建图  22-24
  3：LCR的克隆  24-30
    3.1 人β地中海贫血β~(41／42)突变全血基因组DNA制备  24-25
    3.2 引物设计  25
    3.3 PCR扩增  25-27
    3.4 LCR目的片段与pcDNA3.1(-)质粒载体的双酶切  27-28
    3.5 LCR目的片段与pcDNA3.1(-)质粒载体的连接  28
    3.6 pcDNA3.1-LCR重组质粒的转化、筛选、鉴定和大量制备  28-30
  4：β~(41／42)基因的克隆  30-32
    4.1 引物设计  30
    4.2 PCR扩增  30-31
    4.3 β~(41／42)基因目的片段与pcDNA3.1-LCR质粒载体的双酶切  31-32
    4.4 β~(41／42)基因目的片段与pcDNA3.1-LCR质粒载体的连接  32
    4.5 pcDNA3.1-LCR-β~(41／42)重组质粒的转化、筛选、鉴定和大量制备  32
  5：MEL细胞的脂质体转染  32-35
    5.1 MEL细胞的培养和传代  32-33
    5.2 转染用的重组质粒DNA的制备、纯化及定量  33
    5.3 重组质粒转染MEL细胞(阳离子脂质体介导转染法)  33-35
  6：MELβ~(41／42)细胞株的诱导表达及检测  35-38
    6.1 诱导  35
    6.2 检测  35-38
五 结果分析  38-47
  1：LCR及β~(41／42)基因的克隆  38-43
    1.1 人β地中海贫血β~(41／42)突变全血基因组DNA制备  38
    1.2 LCR及β~(41／42)基因的扩增  38-39
    1.3 重组质粒的PCR和酶切鉴定  39-42
    1.4 基因座控制区LCR的测序  42
    1.5 β~(41／42)基因的测序  42-43
  2：MEL细胞的培养  43
  3：抗性克隆的获得  43-45
    3.1 G418筛选浓度的确定  43-44
    3.2 抗性克隆的筛选  44-45
  4：MELβ~(41／42)总RNA的提取  45
  5：RT-PCR检测人β地贫β~(41／42)突变基因在MEL细胞中的表达  45-47
六 讨论  47-51
七 结论  51-52
八 附录  52-64
  附录一： LCR基因全长测序结果  52-55
  附录二：β~(41/43)基因全长测序结果  55-56
  附录三：LCR测序图谱  56-61
  附录四：β~(41/43)突变基因测序图谱  61-64
九 参考文献  64-71
十 英文缩略词表  71-73
十一 致谢  73

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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