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β-地中海贫血与先天性软骨发育不全诊断性基因芯片的构建

作　者: 胡章雪
导　师: 李力
学　校: 第三军医大学
专　业: 妇产科学
关键词: DNA芯片基因芯片 β-地中海贫血先天性软骨发育不全生物素
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

β-地中海贫血(beta-thalassemia)是一组由于β珠蛋白肽链合成减少或缺乏而引起的以贫血为特征的遗传性血液病,发病率为0.65%,我国南方的高发区约有2-3%的人是突变基因的携带者。目前发现的突变类型达到170余种,其中在中国发现的有21种。β-地中海贫血常见的突变包括CD41-42 (41.6%)、CD17(18%)、TATA-28 (8.0%)、CD71-72(+A) (3.9%)、TATA-29 (1.2%)集中在一段长约600bp的碱基链上。先天性软骨发育不全(achondroplasia,ACH)是由于软骨内成骨缺陷所致的一种最常见的常染色体显性遗传性侏儒,新生儿发病率为1-15/10万。1994年发现ACH的致病基因定位于4p16.3,随后的研究发现ACH是由于成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor 3,FGFR3)跨膜区基因突变所致。目前报道的突变97%以上来自FGFR3基因第10外显子的1138位核苷酸,其中95%为G-A的碱基置换,其余为G-C的转换。通过产前基因诊断包括胚胎植入前诊断(Preimplantation Genetic Diagnosis;PGD)判断胎儿是否携带致病基因,从而防止带病胎儿出生是预防上述两种疾病的有效办法。国内外有条件的实验室已经开展了对单种疾病的胚胎植入前诊断,但受诊断方法和标本量的限制,尚未见能同时诊断多种疾病的检测技术报道,基因芯片技术是近年发展起来的一种新的基因检测技术,该技术的出现为同时诊断两种以上的遗传病提供了可能。在已经建立了单细胞水平基因诊断技术的基础上,本研究针对上述两种疾病的常见基因突变位点,采用寡核苷酸探针和生物素标记显色技术,建立一种能快速、准确地同时检测和鉴定两种疾病特定类型的基因突变位点,操作简便、适合临床使用的基因芯片检测技术。方法与结果:1、通过查阅文献并在GENEBANK上检索获得β-地中海贫血和ACH基因突变所在的DNA片段序列,设计相应的引物, 进行了两种疾病特异性DNA片段的扩增,产物1:包含β-地中海贫血CD41-42、CD17、TATA-28等突变位点(占突变频率的72.7%,600bp),产物2:包含ACH主要突变位点(占突变频率的99%,1264bp),并对扩增条件进行优化,使两个扩增反应能在相同的条件下完成。2、设计4对针对各个突变位点特异性寡核苷酸探针,对探针的特异性、可靠性<WP=9>进行检测,确定了杂交条件。结果显示探针间Tm值相差小于2℃,各探针在G+C含量、发夹结构、自身二聚体以及重复碱基数等指标均符合寡核苷酸探针设计要求,所选用探针特异性强,具有相同的杂交条件,能够区分仅相差一个碱基的靶序列。3、将筛选出的检测探针、阳性对照探针以及阴性探针点在尼龙膜上验证后制成玻璃芯片,用于样品的检测,相应检测探针点及阳性对照均有杂交结果,阴性对照和其他探针点均无显色结果,背景清晰。4、为确定最佳点样探针浓度,进行了探针浓度对探针固定效率和杂交效率的影响研究。结果表明点样探针浓度为1000-2000nmol/L时可获得较好的固定率和杂交效率,因此将制备芯片的探针浓度确定为1500nmol/L。5、为确定最适杂交温度,分别采用40℃,45℃,50℃,55℃为杂交温度,发现在45℃以下杂交时探针特异性不强,50℃以上则灵敏度明显下降;在48℃时实验结果最为稳定,重复10次实验未出现假阳性及假阴性结果。6、芯片杂交后的检测结果可以用肉眼观察。选用TMB与DAB显色,在尼龙膜上杂交时,TMB与DAB均能获得较好的显色结果,但TMB在光照和有氧条件下易分解;在玻璃上杂交时,DAB不论是显色灵敏度还是保存时间均明显优于TMB。7、用该芯片对3例β-地中海贫血和3例临床诊断考虑为软骨发育不全的病例和6例正常样本成功进行了基因诊断,与其他基因诊断方法结果一致。结论:1、采集β-地中海贫血与先天性软骨发育不全患儿的血液标本,构建了能够同时检测β-地中海贫血与先天性软骨发育不全的常见突变位点的基因芯片,建立了同时诊断两种遗传病的基因诊断技术,为产前诊断先天遗传性疾病、控制出生缺陷提供了技术支持。经MEDLINE检索,国内外均未见报道;2、该芯片制作成本低,重复性好,特异性高,能满足临床标本检测的要求,芯片检测时不需要特殊设备,操作方法简单,在三级以上医院均可开展,具有良好的临床应用前景。

全文目录

英文缩写一览表  4-5
英文摘要  5-8
中文摘要  8-10
论文正文 β-地中海贫血与先天性软骨发育不全诊断性基因芯片的构建  10-51
  前言  10-13
  第一部分 β-地中海贫血与先天性软骨发育不全特异性寡核苷酸探针的筛选  13-30
    材料与方法  13-18
    结果  18-24
    讨论  24-28
    附录  28-30
  第二部分 β-地中海贫血与先天性软骨发育不全诊断性芯片的制作与临床应用  30-44
    材料与方法  30-34
    结果  34-38
    讨论  38-41
    附录  41-44
  全文总结  44-45
  致谢  45-46
  参考文献  46-51
文献综述一基因芯片技术在遗传病诊断中的应用  51-61
  参考文献  57-61
文献综述二先天性软骨发育不全的产前诊断  61-68
  参考文献  65-68
研究生期间发表的文章  68

β-地中海贫血与先天性软骨发育不全诊断性基因芯片的构建

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