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鱼类脂味觉的行为学检测及候选脂味受体CD36的克隆与表达

作　者: 刘宁宁
导　师: 刘振辉
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生物工程
关键词: 斑马鱼味觉脂味受体 CD36 行为学
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

味觉是动物对目标食物采取接受或拒绝行为而进行化学感受的最后一步,对于动物摄取食物的安全及动物合理的营养需要十分重要。传统上认为,哺乳动物具有5种基本味觉,即:酸、甜、苦、咸和鲜(umami)。研究表明,人们之所以能够感受酸、甜、苦、咸、鲜味,是因为在味蕾中存在着这五种味觉受体(taste receptor,TR)。近年来对啮齿动物和人类的研究表明可能还存在第六种味觉,即对脂肪酸等脂肪类食物的味觉感受(脂味觉)。研究显示,斑马鱼具有苦味和氨基酸味的感受,但鱼类是否具有脂味感受呢?到目前为止,这还是一个谜。基于此,本论文拟通过行为学实验检测鱼类是否具有对脂肪酸的味觉感受,如果存在,我们拟进一步尝试对鱼类候选脂味受体进行鉴定。由于鱼类生活在水中,给有关鱼类味觉行为学的实验带来不小的难度。我们选取斑马鱼(Danio rerio)和蓝鲨(pangasius sutchi)为代表,进行了一系列的行为学实验来探索鱼类的味觉。对于斑马鱼,我们分别制做了含亚麻酸和亚油酸、氨基酸和苦味剂denatonium benzoat等不同促味剂的饵料,并用荧光染料DiIC12(3)对它们进行了荧光标记,然后分别饲喂斑马鱼,通过录像观察它们对不同食物的吞吐情况,食后迅速解剖肠道在荧光显微镜下观察肠道中食物的荧光强度,分析鱼类对不同食物的偏爱性。结果表明:在斑马鱼摄食的初级阶段,观察到喂养含苦味剂饵料的斑马鱼有明显的吞食后再吐出现象,而喂养亚麻酸和亚油酸或氨基酸饵料的斑马鱼吞食饵料后都没有再吐出现象;我们进一步观察斑马鱼肠道中食物的荧光强度,发现斑马鱼对不同饵料的喜好性为:脂肪酸>氨基酸>苦味剂。综合之,可以认为斑马鱼对含脂肪酸和氨基酸的食物具有偏好性,似乎还更偏好含脂肪酸的饵料,而对含苦味剂denatonium benzoate的饵料有明显的厌恶感。类似地,对于蓝鲨,我们分别制做了含亚麻酸和亚油酸、糖、氨基酸和苦味剂denatonium benzoat等不同促味剂的饵料,然后分别饲喂蓝鲨,观察它们对不同食物的吞吐情况,观察养殖容器中剩余的饵料的多少,计算吃掉饵料占饲喂饵料的百分比,分析它对不同食物的偏爱性。蓝鲨的味觉行为学试验表明:蓝鲨对含甜味剂糖精的饵料非常喜欢,有明显的偏爱,对含脂肪酸和氨基酸的饵料次之,有一定的偏爱,但对含苦味剂denatonium benzoat的饵料不喜欢,甚至厌恶。鱼类中的这些行为学实验证明:鱼类除了具有苦味和氨基酸味的感受外,还具有脂肪酸的味觉感受。另外,我们的实验还发现蓝鲨对甜味具有偏好性,说明鱼类可能具有甜味的味觉感受,这与斑马鱼无甜味觉感受能力的报道不一致。CD36是一种在大鼠和小鼠舌上皮细胞的味蕾中均有表达的脂类黏合蛋白,最近的研究中被确定为感受脂肪酸的受体,尤其是用于识别长链脂肪酸。我们通过生物信息学分析发现,斑马鱼中也存在CD36同源基因。通过RT-PCR和实时荧光定量PCR分别确定了CD36在不同成鱼组织和不同胚胎发育时期中的表达。研究表明:CD36在不同成鱼组织中的中的表达如下:在肠中的表达量最高,在肝、鳃、脾中表达量次之,而在脊椎、肾、脑、鳔中表达量相对较低。CD36在胚胎发育早期表达较高,在囊胚期的表达量达到最高;随后逐渐降低,直到孵化期才重新开始出现升高。这些研究,为进一步阐明鱼类CD36基因在味觉感受中的作用奠定了基础。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章文献综述  11-27
  1 味觉及味觉受体  11-19
    1.1 引言  11
    1.2 甜味以及甜味受体  11-12
    1.3 苦味以及苦味受体  12-13
    1.4 鲜味以及鲜味受体  13
    1.5 酸味以及酸味受体  13-14
    1.6 咸味及咸味受体  14-15
    1.7 脂味及其候选受体  15-16
    1.8 味蕾的结构以及味觉受体细胞  16-19
  2 脂味受体蛋白CD36 的结构、分布及功能  19-23
    2.1 引言  19-20
    2.2 CD36 的结构  20-21
    2.3 CD36 的分布  21-22
    2.4 CD36 的功能  22-23
  3 模式生物斑马鱼  23-25
  4 研究目的、意义及技术路线  25-27
    4.1 研究目的和意义  25-26
    4.2 技术路线  26-27
第二章鱼类脂味觉行为学检测  27-37
  1 前言  27-28
  2 材料和方法  28-34
    2.1 实验动物  28
    2.2 实验仪器  28
    2.3 制作包含各种促味剂的饵料  28-30
    2.4 试验方法  30
    2.5 结果  30-34
  4 讨论  34-37
    4.1 颗粒饵料的改进  34-35
    4.2 试验对象的选取以及检测方法的异同  35
    4.3 鱼类的味觉行为  35-37
第三章候选脂味受体CD36 的克隆与表达  37-56
  1 前言  37-38
  2 实验材料  38-39
    2.1 实验动物  38
    2.2 主要化学试剂及仪器设备  38-39
  3 方法  39-47
    3.1 CD36 基因片段的克隆  39-45
    3.2 Real-Time PCR 技术分析CD36 在斑马鱼各胚期的表达  45-46
    3.3 半定量PCR 检测CD36 在成体斑马鱼不同组织的表达情况  46-47
  4 结果  47-54
    4.1 CD36 基因序列的获取  47-48
    4.2 多序列比对与序列相似性分析  48-50
    4.3 系统进化分析  50-53
    4.4 CD36 在斑马鱼各组织中的表达量  53
    4.5 CD36 在斑马鱼各胚期的表达量  53-54
  5 讨论  54-56
第四章总结与展望  56-58
  1 总结  56
  2 展望  56-58
参考文献  58-64
致谢  64-65
个人简历  65

鱼类脂味觉的行为学检测及候选脂味受体CD36的克隆与表达

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