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尼帕病毒性脑炎诊断与免疫防制技术的研究

作　者: 王喜军
导　师: 申之义；步志高
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 尼帕病毒融合蛋白受体结合蛋白重组杆状病毒重组痘病毒 DNA免疫
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

尼帕病毒性脑炎(Nipah virus Encephalitis,NiVE)是由尼帕病毒(Nipah virus,NiV)引起的一种新的烈性人兽共患传染病,也是国际上重要的生物武器研究对象及生物反恐防范对象。 NiV 为副粘病毒科 ( Paramyxoviridae ) 副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)的 Henipavirus 属成员。融合蛋白 F 和受体结合蛋白 G 是 NiV的主要结构蛋白及免疫原。本研究构建了分别表达 NiV 融合蛋白 F 和受体结合蛋白 G 的重组杆状病毒rBac-NF 和 rBac-NG。SDS-PAGE、Western-Blot 表明分子量分别为 61KD 和 66KD 左右的重组 F 蛋白(rNF)和 G 蛋白(rNG)在 rBac-NF 和 rBac-NG 感染的 sf9 昆虫细胞中获得表达,并具有特异免疫反应原性。以 rBac-NF 和 rBac-NG 感染的昆虫细胞裂解物稀释后直接包被 ELISA 板,检测兔抗灭活 NiV 全病毒高免血清中抗 F 蛋白、G蛋白特异抗体时,显示出高度敏感性和特异性。以 rBac-NF、rBac-NG 分别感染 sf9细胞和培养上清混合物为免疫原,按 250μl 剂量腹腔注射和 100μl 剂量肌肉注射免疫 BALB/c 小鼠。以 NiV F 蛋白和 G 蛋白囊膜嵌合水疱性口炎病毒(VSV)假病毒颗粒(表示为 VSV?G* GFP-NiV(F+G))替代 NiV 进行中和抗体检测,按病毒粒子感染率80%以上被抑制为判定标准,重组杆状病毒rBac-NF和rBac-NG表达蛋白rNF和 rNG 免疫小鼠诱导中和抗体滴度分别在 1:32 和 1:64 以上,rNG 免疫小鼠诱导中和抗体水平高于 rNF。结果表明,杆状病毒表达 rNF 和 rNG 具有替代 NiV 全病毒,作为非疫区安全、敏感和特异的诊断抗原的潜力;rNF 和 rNG 作为重组亚单位疫苗具有防制 NiVE 的应用潜力。本研究进一步分别构建了表达 F 蛋白和 G 蛋白的重组 WR 株牛痘病毒 rVV-NF 和rVV-NG。SDS-PAGE、Western-Blot 证实,分子量分别为 61KD、66KD 左右的 F 蛋白和 G 蛋白分别在 rVV-NF 和 rVV-NG 感染的 Hela 细胞中获得表达。细胞融合试验结果显示 rVV-NF 和 rVV-NG 表达的重组 F 蛋白和 G 蛋白具有良好的生物学活性。为 NiV F蛋白和 G 蛋白结构与功能以及基因工程活载体疫苗的研究奠定了基础。为探索 DNA 疫苗防制 NiVE 的有效性,本研究构建了表达 NiV 融合蛋白 F 和受体结合蛋白G的真核表达质粒pCAGG-NiV-F和pCAGG-NiV-G。两种质粒DNA分别按100μg剂量肌肉注射免疫 BALB/c 小鼠。两次加强免疫, 三周后以杆状病毒表达 F 蛋白、G蛋白为包被抗原,间接 ELISA 分别检测到免疫鼠血清产生显著的 NiV F 蛋白、G 蛋白特异抗体反应;同时,用 NiV F 蛋白、G 蛋白囊膜嵌合 VSV 假病毒颗粒 VSV?G* GFP-NiV(F+G)替代 NiV 进行中和抗体检测,按病毒粒子感染率 80%以上被抑制为判定标准,pCAGG-NiV-G DNA 免疫小鼠诱导中和抗体滴度(在 1:32 以上)高于pCAGG-NiV-F DNA 免疫小鼠诱导中和抗体滴度(在 1:2 以上)。研究结果证实 DNA 免

全文目录

1 引言  9-19
  1.1 尼帕病毒性脑炎概况  9-11
    1.1.1 流行病学  9-10
    1.1.2 临床表现  10-11
    1.1.3 病理学变化  11
  1.2 病原及其分子生物学特性  11-14
    1.2.1 病原  11-12
    1.2.2 尼帕病毒的基因组结构、结构蛋白及其功能  12-14
  1.3 NiV与其它副粘病毒的关系  14-16
  1.4 NiVE的诊断  16-17
  1.5 预防与控制  17
  1.6 本论文研究依据及意义  17-19
2 实验部分  19-53
  2.1 试验一尼帕病毒F蛋白和G蛋白DNA免疫原性的研究  19-25
    2.1.1 材料与方法  19-22
      2.1.1.1 病毒  19-20
      2.1.1.2 基因材料与载体  20
      2.1.1.3 主要试剂  20
      2.1.1.4 细胞系与实验动物  20
      2.1.1.5 一步法制备DH5α大肠杆菌感受态  20
      2.1.1.6 真核表达质粒pCAGG-NiV-F和pCAGG-NiV-G的构建与鉴定  20-21
      2.1.1.7 真核表达质粒pCAGG-NiV-F和pCAGG-NiV-G的大量制备  21
      2.1.1.8 NiV-F和NiV-G基因表达蛋白的生物活性检测  21
      2.1.1.9 DNA免疫小鼠实验  21
      2.1.1.10 间接ELISA检测DNA免疫小鼠血清中的特异性抗体  21-22
      2.1.1.11 中和试验检测DNA免疫小鼠血清中的特异性中和抗体  22
    2.1.2 结果  22-24
      2.1.2.1 真核表达质粒pCAGG-NiV-F和pCAGG-NiV-G的酶切鉴定  22
      2.1.2.2 NiV F和G基因表达蛋白的生物活性检测  22-23
      2.1.2.3 间接ELISA检测DNA免疫小鼠血清中的特异性抗体  23
      2.1.2.4 中和试验检测DNA免疫小鼠血清中的特异性中和抗体  23-24
    2.1.3 讨论  24-25
  2.2 实验二重组杆状病毒表达尼帕病毒F和G蛋白的研究  25-45
    2.2.1 材料与方法  25-36
      2.2.1.1 病毒、载体和受体菌  25-26
      2.2.1.2 主要试剂  26
      2.2.1.3 细菌培养基  26
      2.2.1.4 实验动物、细胞系及其培养基  26
      2.2.1.5 引物的设计与合成  26-27
      2.2.1.6 利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组病毒  27-31
      2.2.1.7 间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达蛋白  31
      2.2.1.8 原核表达F蛋白和G蛋白片段免疫小鼠制备血清  31-34
      2.2.1.9 重组杆状病毒表达蛋白的Western Blot检测  34-35
      2.2.1.10 重组杆状病毒表达蛋白免疫反应原性的检测  35
      2.2.1.11 重组杆状病毒表达蛋白免疫原性的检测  35-36
    2.2.2 结果  36-43
      2.2.2.1 重组质粒pFastBac~(TM)1-NF和pFastBac~(TM)1-NG的鉴定  36-37
      2.2.2.2 重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-NF和rBacmid-NG的鉴定  37
      2.2.2.3 重组杆状病毒的PCR鉴定  37-38
      2.2.2.4 间接免疫荧光（IFA）检测重组杆状病毒表达蛋白  38
      2.2.2.5 PCR扩增F’和G’基因  38
      2.2.2.6 序列测定  38-39
      2.2.2.7 原核表达质粒的鉴定  39
      2.2.2.8 原核表达F’和G’蛋白SDS-PAGE电泳分析  39-40
      2.2.2.9 原核表达蛋白的纯化  40
      2.2.2.10 重组杆状病毒表达蛋白的Western-Blot检测  40-41
      2.2.2.11 重组杆状病毒表达蛋白免疫反应原性的检测  41
      2.2.2.12 重组杆状病毒表达蛋白免疫原性的检测  41-43
    2.2.3 讨论  43-45
  2.3 实验三表达尼帕病毒F和G蛋白重组牛痘病毒的构建  45-53
    2.3.1 材料与方法  45-48
      2.3.1.1 病毒、基因材料  45
      2.3.1.2 载体、菌株和试剂  45
      2.3.1.3 引物设计  45
      2.3.1.4 重组转移载体pSC11-NF和pSC11-NG的构建  45-46
      2.3.1.5 转染  46-47
      2.3.1.6 重组牛痘病毒的筛选  47
      2.3.1.7 重组牛痘病毒的鉴定  47-48
      2.3.1.8 重组牛痘病毒表达蛋白活性的检测  48
    2.3.2 结果  48-52
      2.3.2.1 重组转移载体pSC11-NF和pSC11-NG的鉴定  48-49
      2.3.2.2 重组牛痘病毒的蚀斑纯化  49-50
      2.3.2.3 重组牛痘病毒的PCR鉴定  50
      2.3.2.4 重组牛痘病毒表达蛋白活性的检测  50-52
    2.3.3 讨论  52-53
3 结论  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-61
附录  61-63
作者简介  63

尼帕病毒性脑炎诊断与免疫防制技术的研究

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