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重组大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶体外分子交联的初步研究

作　者: 李永海
导　师: 高音
学　校: 首都师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 蛋白质二硫键异构酶异肽键蛋白质分子间交联热变性 DNA定突变谷氨酸脱氢酶
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

蛋白质交联是生物体内普遍存在的一种分子间交联形式,与许多生理及病理过程密切相关。蛋白质如何由单体（有功能的形式）转变为交联的二聚体或多聚体的分子机理还不完全清楚。一种假说认为蛋白质分子间交联可以通过以下三步实现:1) 蛋白质构象包括二级结构改变;2) 形成分子间二硫键;3) 分子间其他共价键（异肽键）的形成。本文为了证实或完善和补充蛋白质分子交联的三步假说,以原核生物的蛋白NADP特异性谷氨酸脱氢酶（NADP-GDH）和鸡溶菌酶作为实验材料,采用PCR方法从大肠杆菌DH_5a菌株中克隆得到NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因,构建重组表达质粒并在大肠杆菌中高效表达重组NADP-GDH,应用（His）₆亲和标签和固定化金属亲和层析技术纯化出重组NADP-GDH,在体外进行热诱导去折叠和氧化重折叠实验。结果发现:纯化的野生型重组NADP-GDH经热变性,SDS-PAGE结果显示出现了二聚体和多聚体条带;而在相同条件下,当反应体系或上样缓冲液中加入还原剂二硫苏糖醇后没有二聚体或多聚体的形成。实验结果显示,野生型NADP-GDH有很强的形成异肽键交联二聚体的倾向,而在同样条件下,半胱氨酸残基定点突变后的NADP-GDH重组蛋白无法形成分子间二硫键,实验证实经过热诱导去折叠后也没有出现分子间其他共价键（异肽键）交联形式。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-5
缩略表  5-7
第一章综述  7-31
  1.1 与蛋白质交联相关的生理及病理过程  7-13
  1.2 蛋自质交联的机理  13-25
  1.3 蛋白质折叠中的辅助蛋白  25-29
  1.4 谷氨酸脱氢酶简介及本文研究目的  29-31
第二章材料和方法  31-38
  2.1 材料  31
  2.2 方法  31-38
第三章结果与分析  38-47
  3.1 琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增的目的基因  38
  3.2 目的基因序列分析  38-39
  3.3 酶切鉴定重组质粒  39-40
  3.4 IPTG和温度诱导表达目的蛋白  40-41
  3.5 目的蛋白的纯化  41-42
  3.6 目的蛋白的浓度测定  42-43
  3.7 热诱导去折叠实验  43-47
第四章讨论与展望  47-56
  4.1 实验设计  47-50
  4.2 谷氨酸脱氢酶结构和功能之间的关系  50-52
  4.3 实验结果与蛋白质交联三步假说  52-56
  4.4 展望  56
第五章小结  56-57
参考文献  57-63
附录一  63-66
附录二  66-69
附录三  69-73
附录四  73-75
致谢  75

重组大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶体外分子交联的初步研究

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