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重组阳离子抗菌肽的研究

作　者: 吴卫华
导　师: 陈劲春
学　校: 北京化工大学
专　业: 生物化工
关键词: 阳离子抗菌肽基因重组摇瓶发酵条件优化体外抑菌活性
分类号: TQ464
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

本实验室设计合成了一段长度为207bp的DNA序列作为目的基因片段,克隆进载体pBluescript-M13,并测定载体核苷酸序列,绘制了物理图谱。研究中,我们选用巴斯德毕赤酵母作为基因表达系统,分泌型质粒pPIC9作为载体,构建了基因工程菌。重组质粒pPIC9-Atmp经限制性内切酶BglⅡ酶切线性化后,电穿孔转化入受体菌巴斯德毕赤酵母GS115。经MD和MM平板筛选得到his+Muts表型的阳性克隆JCC-2 23株。小规模地培养基因工程菌JCC-2后,进行目标蛋白阳离子抗菌肽的诱导表达。发酵上清液经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳, 从分子量分析推测目标蛋白以聚合体形式存在。蛋白聚合体经巯基乙醇处理后,再进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳,发现目标蛋白以单体存在,经凝胶成像系统分析,单体分子量约为6000,最大表达量达29.67mg/l。发酵上清液体外抑菌活性实验表明:发酵上清液对微黄色八叠球菌和大肠杆菌具有毒杀力,30μl,96小时的发酵上清液对微黄色八叠球菌抑菌直径达2.6cm,对大肠杆菌抑菌直径为2.36cm。发酵上清液的抑菌半径随着发酵时间的延长而增大。等量发酵上清液对八叠球菌的抑菌效果较大肠杆菌明显。通过工程菌部分发酵条件优化,得到部分摇瓶发酵最优条件如下:JCC-2的最佳生长培养基为BMGY,生长培养基BMGY最佳初始pH为6.0,菌体生长70小时达到最大生物量24.7g/l,<WP=4>蛋白表达量在诱导培养基上生长96小时达到最大,为29.67mg/l。通过本研究,重组质粒pPIC9-Atmp线性化后,电转化进入受体菌巴斯德毕赤酵母GS115后,筛选出阳性克隆菌株和高拷贝菌株,验证了目标蛋白表达的正确性,并测定了表达量。同时验证了目标蛋白体外抑菌活性并优化了部分摇瓶发酵条件,为进一步研究打下基础。

重组阳离子抗菌肽的研究

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