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肿瘤坏死因子-α对肠上皮细胞通透性的影响及机制研究
作 者: 王国丽
导 师: 尹飞
学 校: 中南大学
专 业: 儿科学
关键词: 肿瘤坏死因子-α Caco-2细胞 肌动蛋白 核因子-κB 细胞间通透性
分类号: R363
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
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研究背景与目的肠黏膜屏障是机体最重要的免疫防御屏障之一,它将机体与肠道内的外源性物质隔离开来,避免病原微生物侵袭和抗原分子的损伤。肠黏膜屏障包括肠上皮细胞屏障、免疫屏障和微生物屏障,而肠上皮细胞屏障是其最重要的一道屏障,是肠黏膜屏障具有选择性通透的基础。目前研究发现肠上皮细胞屏障通透性增高参与多种疾病的发生(如炎症性肠病、败血症、烧伤等),并且在这些情况下,血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)明显升高,与肠上皮细胞屏障的损害程度呈正相关,抗TNF-α抗体可以恢复受损的肠上皮细胞屏障。因此认为TNF-α是增加肠上皮细胞屏障通透性的重要因素。虽然目前已经形成共识TNF-α可以增加肠上皮细胞屏障的通透性,但其具体作用机制和方式还存在争议。早期认为与TNF-α引起的细胞凋亡密切相关,近年来则倾向于TNF-α引起肠上皮细胞屏障损伤是凋亡非依赖性的。另外TNF-α引起肠上皮细胞屏障通透性增高的具体调控环节也不十分清楚,它可能与蛋白激酶C(PKC)、核因子一κB(NF-κB).肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)等信号途径有关。因此本研究利用Caco-2细胞株建立体外肠上皮细胞屏障模型,观察TNF-α对其通透性的影响,并探讨TNF-α导致肠上皮细胞屏障通透增加的可能机制。研究方法1体外肠上皮细胞屏障模型的建立应用Caco-2细胞株建立体外肠上皮细胞屏障模型,应用跨上皮细胞电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)指标检测肠上皮细胞屏障的形成情况。2质粒转染及分组待Caco-2细胞成紧密单层后无血清培养24h,根据有无转染NF-K B抑制质粒(Mu-IκB)将其分为Mu-IκB质粒转染组(M-TNF-α组)和Mu-IκB质粒未转染组(TNF-α组)。进一步根据TNF-α组预处理时间,两组分别分为M-TNF-α0、3、6、12、24h；TNF-α0、3、6、12、24h 5个亚组,各亚组于其相应的时间点在Transwell基底侧加入100μg/L TNF-α分别孵育0、3、6、12、24h,其中Oh亚组未予TNF-α刺激。3 TNF-α对肠上皮细胞屏障通透性的影响加入100μg/L TNF-α作用不同时间(0、3、6、12、24h),观察各组Caco-2细胞屏障TEER的改变。4 TNF-α对肠上皮细胞NF-κB活性的影响加入100μg/L TNF-α作用不同时间(0、3、6、12、24h),采用荧光素酶报告基因检测Caco-2细胞NF-κB活性。5 TNF-α对肠上皮细胞肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)磷酸化的影响加入100μg/L TNF-α作用不同时间(0、3、6、12、24h),采用蛋白质印迹法(western blot)检测MLC磷酸化蛋白的表达水平6 TNF-α对肠上皮细胞F-actin的影响加入100μg/L TNF-α作用不同时间(0、3、6、12、24h),罗丹明-鬼笔环肽直接染色免疫荧光显微镜下观察Caco-2细胞间F-actin改变。研究结果1 TNF-α致肠上皮细胞的通透性变化TNF-α引起Caco-2细胞TEER降低,并具有时间依赖性。TNF-α作用3h后,TEER值下降,与TNF-α0h组比较差异有显著性降低(P<0.05),TNF-α作用24h,TEER降至最低,是TNF-α0h组的68.7%。抑制NF-κB的活性(转染Mu-IκB质粒)后,TNF-α引起Caco-2细胞TEER降低,M-TNF-α各亚组与TNF-α相应各亚组相比,其TEER降幅均有显著减少(P<0.05)。2 TNF-α致肠上皮细胞NF-κB的活性变化TNF-α3h、6h、12h组NF-κB活性增高,与TNF-α0h组比较有显著性差异(均P<0.05),其中TNF-α12h亚组NF-κB活性最高,与TNF-α0h、3h、6h、24h亚组比较有显著性差异(均P<0.05)。转染Mu-IκB质粒后TNF-α作用3h时NF-κB活性开始增高,与M-TNF-α0h组比较有显著性差异(P<0.05),随作用时间延长,NF-κB活性进一步增高,12h达到最高,随后NF-κB活性下降。M-TNF-α各亚组与TNF-α相应各亚组相比,其NF-κB活性增高幅度均有显著性降低(P<0.05)。3 TNF-α致肠上皮细胞MLC磷酸化水平变化与TNF-αOh组比较,TNF-α作用6h,MLC磷酸化水平增加,转入Mu=IκB质粒后,TNF-α作用6h,MLC磷酸化水平无明显改变,作用12h才出现MLC磷酸化增加。显示降低NF-κB活性后TNF-α引起MLC磷酸化作用延迟。4 TNF-α致肠上皮细胞间F-actin变化正常CaCo-2细胞,紧密连接结构完整,呈致密的带状结构。加入100μg/L TNF-α作用12h细胞外周致密带边缘变得毛糙不规整,细胞荧光染色减弱,作用24h细胞外周轮廓模糊难辨,逐渐出现锯齿样断裂,趋于变细崩解消散。转染Mu-IκB质粒后,M-TNF-α3、6、12h组Caco-2细胞的F-actin无明显改变,M-TNF-α24h组细胞外周致密带边缘开始变得毛糙不规整,细胞荧光染色减弱。研究结论肠上皮细胞MLC磷酸化及F-actin重组是TNF-α致其通透性增高的机制之一,此过程可能受NF-κB的调控。
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全文目录
摘要 5-9
ABSTRACT 9-14
缩略词简表 14-15
第一部分 TNF-α对肠上皮细胞屏障通透性的影响 15-22
1 前言 15-16
2 材料与方法 16-18
2.1 主要试剂 16
2.2 主要仪器 16
2.3 实验方法与步骤 16-17
2.4 统计学处理 17-18
3 结果 18-19
4 讨论 19-21
4.1 肠上皮细胞屏障模型的建立 19
4.2 TNF-α致肠上皮细胞屏障通透性的变化 19-21
5 结论 21-22
第二部分 TNF-α致肠上皮细胞通透性增高的机制研究 22-39
1 前言 22-24
2 材料与方法 24-30
2.1 主要试剂 24
2.2 主要仪器 24-25
2.3 方法方法与步骤 25-29
2.4 统计学处理 29-30
3 结果 30-34
3.1 肠上皮细胞NF-κB活性变化 30
3.2 肠上皮细胞TEER变化 30
3.3 肠上皮细胞MLC磷酸化的表达变化 30
3.4 肠上皮细胞F-actin变化 30-34
4 讨论 34-38
4.1 TNF-α致肠上皮细胞通透性增高与F-actin重组相关 34-35
4.2 肠上皮细胞F-actin重组与MLC磷酸化相关 35
4.3 MLC磷酸化及F-actin重组与NF-κB调控相关 35-37
4.4 小结 37-38
5 结论 38-39
参考文献 39-45
综述 45-56
参考文献 51-56
致谢 56-57
攻读学位期间已发表的论文 57
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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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