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人巨细胞病毒UL82基因重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

作　者: 毛敬伟
导　师: 李黔生
学　校: 第三军医大学
专　业: 外科学
关键词: 人巨细胞病毒 pp71 人包皮成纤维细胞大肠杆菌克隆蛋白表达
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

人巨细胞病毒(HCMV)含有约20-25种蛋白质,其中在介导HCMV感染和病毒复制中有3种蛋白作用最为重要,即由ORFUL82编码的磷蛋白pp71、ORF UL83编码的pp65蛋白和ORF UL69编码的pUL69蛋白。上述3种蛋白共同的特点是启动HCMV对宿主细胞的感染和病毒的复制,同时在逃逸T淋巴细胞介导的细胞毒性作用中也具有重要作用。新近的研究表明,在这3种间层蛋白中以ORFUL82编码的蛋白pp71的作用最为显著,该PP71蛋白单独存在时,是一种较强的抗原蛋白,可刺激机体产生抗体,有助于清除病毒;在器官移植者,HCMV的感染后pp71蛋白的产生可以明显增强细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达,从而引起移植物血管病变和排斥反应[1];在视网膜母细胞瘤,pp71蛋白的产生可以引起肿瘤蛋白p105,p107,p130等的衰变[2,3]。pp71蛋白可以诱导静止的细胞进入细胞周期并使他们停在G1晚期,而这段时期对病毒复制最为有利,所以它能够增加病毒繁殖,加快病毒在细胞间传递,体外将HCMV转染人纤维母细胞后,病毒DNA复制效率在共转染ORF UL82(pp71蛋白)条件下,感染及复制效率增加了80倍[4～8]。研究证实pp71不仅对HCMV的IE1和IE2基因表达有促进作用,而且对晚期基因的表达以及病毒向正常宿主细胞的传播具有促进和加强作用。因此,Baldick指出,ORF UL82(pp71蛋白)可作为抗CMV病毒药物设计的有效靶点[9]。为了进一步研究PP71蛋白基因在大肠杆菌(E.coli)中的表达,为下一步蛋白的大量表达纯化和基因工程抗体库的筛选奠定基础。本研究进行了以下工作:1. 人巨细胞病毒的培养。.在传代培养的人包皮成纤维细胞(HFF)中接种人巨细胞病毒,并在含2%小牛血清的DMEM维持液中继续培养至绝大多数的细胞都出现了明显的细胞病变效应(CPE)时,冻融法收获细胞,保存在-70℃。免疫组化方法检测培养细胞中的pp65抗原显示绝大多数的细胞已经成功感染了巨细胞病毒。2. 人巨细胞病毒pp71基因的克隆及pGEX/pp71重组表达质粒的构建利用蛋白酶K法提取HCMV DNA。设计引物、PCR扩增pp71基因目的片段。 <WP=9>BamHI和EcoRI内切酶双酶切目的片段和质粒pGEX-4T-1。并将pp71基因目的片段连接到pGEX-4T-1上。利用氯化钙法将重组质粒pGEX/pp71转入DH5(大肠杆菌内。提取重组质粒pGEX/pp71,以BamHI和EcoRI双酶切方法和PCR方法初步鉴定重组质粒,然后测序。对PP71基因DNA片段的测序结果,与基因库中的标准序列比较,同源性约为99.6%,说明重组质粒构建成功。3. pGEX/pp71重组质粒在大肠杆菌中的表达及其表达条件的优化当蛋白表达条件为诱导温度为37?℃、诱导时间4h、IPTG浓度0.4～0.5mM/ml,能高效地表达出分子量约为71KD的目的蛋白,与理论分子量一致,占菌体总蛋白的30%左右。

人巨细胞病毒UL82基因重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

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