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林蛙人工繁育及18S测序的研究

作　者: 宁方勇
导　师: 白秀娟
学　校: 东北农业大学
专　业: 动物遗传育种
关键词: 林蛙放射免疫分子系统学
分类号: S966.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 172次
引　用: 3次
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内容摘要

两栖类在整个生物系统中是一个较为特殊的类群，是一个由水生到陆生的过渡类型。由于其独特的生物学特性，因此与人类生活自古以来就有密切关系。明代李时珍《本草纲目》一书记载药用两栖类9种。建国以来，祖国传统医药学受到重视和发展，据《四川中药志》(1962)和《中国药用动物志》第一册(1979)、第二册(1983)记载，药用两栖类达22种。到目前为止，据不完全统计，已有文献记载的药用两栖类增加到32种。我国的药用两栖动物资源甚为丰富，不少种类尚未开发利用。由于其肉蛋白质含量高，有多种人体必需的氨基酸和微量元素，营养丰富，且具有药效，其食用价值早为人类所知。近年来，随着经济的发展及人们生活水平的提高，人们对食品安全的要求越来越高，因此利用蛙科动物进行生物防治害虫，生产绿色食品在祖国各地蓬勃兴起。而蛙科动物在自然界分布广、数量多，主要以作物的害虫等小昆虫为食，利用蛙科动物进行生物防治，结果证实投入少，效果明显，生态效益显著。尽管蛙科动物用途广泛，对人类益处多多，然而近年来由于乱捕滥猎、生态环境遭到破坏、环境污染等原因，使得其在自然界中的数量锐减，很多已经灭绝或处于濒危状态，亟待人们的保护和拯救。这也在全国范围内掀起了一股饲养蛙类的热潮，但是现阶段的饲养绝大多数是半人工半散养，而且饲养中尚存有很多问题亟待解决。因此作者通过放射免疫方法测定了林蛙生殖腺激素水平，进而用不同激素实现了林蛙的非繁殖季节的繁殖，突破了林蛙养殖的瓶颈。此方法简单易行，重复性好。并且初步明确了黑龙江两种林蛙类必须经过冬眠才能进入繁殖状态。由于物种地理分布的特殊性，作者查阅了大量的相关文献，此项研究国内外尚未有报道。蛙科动物是由水生到陆生的过渡型，由于其形态机能还不完善，而必须依赖水域或潮湿环境，因此运动能力弱，不能做远距离的迁徙。因此，蛙科动物在自然界的地理分布较其他脊椎动物相对稳定，其分布规律往往成为动物地理区划研究较为可靠的依据。由于常规分类学方法具有一定的局限性，因此人们越来越多的借助于分子生物学的方法和手段来对各物种进行重新的认识。由于rDNA的碱基顺序可作为研究生物系统进化和分类的可靠参照物，随着mtDNA序列的大量积累，人们可以越来越多的得到核DNA的信息，来对mtDNA的资料进行补充，以便在系统学研究中对所言及的对象有一个更为全面准确地认识。本研究对黑龙江两种林蛙的核糖体18SrDNA进行了克隆和测序，发送到GenBank上(序列号分别是：AY145522 AF541872)对其物种间同源性进行比较研究，探讨了两种动物的遗传分化关系，分子系统学进化关系。

全文目录

摘要  7-8
英文摘要  8-10
1 引言  10-22
  1.1 黑龙江省林蛙类概述  10-17
    1.1.1 中国林蛙  10-12
    1.1.2 黑龙江林蛙  12
    1.1.3 林蛙类的经济价值  12-17
  1.2 放射免疫测定法  17
  1.3 人工排卵  17-18
  1.4 分子系统学  18-20
    1.4.1 分子系统学  18
    1.4.2 分子标记  18-19
    1.4.3 核糖体基因在分子系统学中的应用  19-20
  1.5 林蛙分子系统学研究概况  20-21
  1.6 本研究的目的和意义  21-22
2 材料与方法  22-33
  2.1 实验动物  22
  2.2 主要试剂和药品的配制  22-25
    2.2.1 放免药品  22
    2.2.2 人工排卵药品  22-23
    2.2.3 分子系统学药品  23-25
  2.3 主要仪器设备  25
  2.4 实验方法  25-33
    2.4.1 放免样品的处理  25-26
    2.4.2 林蛙人工排卵的处理  26-27
    2.4.3 DNA的提取  27
    2.4.4 引物的设计与合成  27-28
      2.4.4.1 林蛙18S测定所采用的引物  27-28
    2.4.5 PCR扩增  28-29
      2.4.5.1 PCR反应体系  28
      2.4.5.2 PCR反应程序  28
      2.4.5.3 PCR产物回收  28-29
    2.4.6 感受态细胞的制备  29
    2.4.7 PCR产物的连接  29-30
    2.4.8 连接产物的转化  30
    2.4.9 转化菌落的PCR鉴定与培养  30-31
    2.4.10 小量质粒抽提纯化操作步骤  31
    2.4.11 质粒的酶切鉴定  31-32
    2.4.12 PCR克隆产物的序列测定  32
    2.4.13 序列处理  32-33
3 实验结果  33-43
  3.1 激素测定结果  33-34
  3.2 人工排卵结果  34-37
  3.3 18s序列测定结果  37-43
    3.3.1 林蛙基因组DNA图像  37
    3.3.2 林蛙18S扩增结果  37-38
    3.3.3 克隆质粒酶切结果  38-39
    3.3.4 DNA序列分析  39-43
4 讨论  43-46
  4.1 放免测定结果的讨论  43-44
  4.2 人工排卵结果的讨论  44-45
  4.3 18s测定结果的讨论  45-46
5 结论  46-47
  5.1 放免测定的结论  46
  5.2 人工排卵的结论  46
  5.3 18s序列测定的结论  46-47
参考文献  47-50
附录  50-51
攻读硕士期间所发表的论文  51-52
致谢  52

林蛙人工繁育及18S测序的研究

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