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转Bt抗虫基因植物的酶联免疫检测技术研究

作　者: 严吉明
导　师: 叶华智
学　校: 四川农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: Bt抗虫基因杀虫蛋白抗原抗体酶联免疫检测（ELISA）
分类号: S432
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

培育和利用抗虫品种是防治作物害虫最经济有效的措施。通过转抗虫基因培育抗虫品种是重要方法之一。此项工作中需要对转基因植物进行鉴定和筛选，因此发展快速、准确、简便的检测技术具有重要的作用和意义。本研究以检测目前抗虫转基因育种中研究最多、获得成效最大的转Bt抗虫基因的表达产物（杀虫蛋白）为检测目标。为此研究了影响抗原和抗体制备的主要因素，制备出灵敏度高的特异抗体，在此基础上开展检测方法研究，掌握影响检测效果的有关因素，从而初步建立起灵敏度高的ELISA检测技术。本研究取得如下结果：抗原是影响抗体特异性和效价的重要因素，为了得到产量高、质量好的杀虫晶体蛋白作为抗原，我们研究了Bt菌培养时间、伴孢晶体蛋白裂解液的种类和处理温度与时间对杀虫蛋白提取的影响。结果表明Bt HD-1菌株在趴生长繁殖培养基（Singer等，1968）上，30℃下培养41-55h均可获得大量孢晶混合物。采用50mMNa₂CO₃（含50mM EDTA，3％巯基乙醇，pH10）裂解液和0.04N Na0H的裂解液处理孢晶混合物，均可获得大量的130KD杀虫蛋白。但用0.04N NaOH提取的杀虫蛋白中含有较多杂蛋白。所研究的处理温度和时间对杀虫蛋白提取量和组成无明显影响。抗原的免疫剂量是影响抗体产生的一个重要因素，免疫剂量过大会引起麻痹反应。为了提高免疫效果，获得较好的抗体。我们采用两种抗原剂量（750ug／只.次和375 ug／只.次）免疫家兔，结果表明所供试的两种剂量对抗血清效价和特异性无明显影响。因此采用任一种剂量免疫家兔均可。本研究制备的抗体用于检测标准抗原，灵敏度可达7.8-16.5ng。在建立检测方法研究上，采用ELISA间接检测法，测定了两种酶标羊抗兔抗体（辣根过氧化物酶与碱性磷酸酶）和两种载体（聚苯乙烯酶标板和硝酸纤维膜）对检测灵敏度和样本检测效果的影响。结果表明，在采用纯的杀虫蛋白进行灵敏度检测时，二种酶标抗体和两种检测载体的测定结果非常相近，无明显差别。但在对植物样本检测时，不同酶标抗体和载体则存在差异。表现为碱性磷酸酶标记的抗体优于辣根过氧化物酶标记的抗体。这主要是由于植物样本中存在有内源过氧化物酶的干扰。在两种检测载体上，由于植物样本中存在叶绿素，采用硝酸纤维膜进行Dot-ELISA检测时，叶绿素色斑干扰较大。如何排除叶绿素在D。t－ELISA检测中的影响，尚值得研究。通过本研究，基本掌握了提取杀虫蛋白作为抗原和兔疫家兔制备抗血清的有关因素和条件，制备出了特异性强的抗体，检测灵敏度可达 7．8刁．6ng。通过检测方法研究，明确了影响检测的一些因素并初步建立起了检测棉叶样本中Bt杀虫蛋白的相关技术。

全文目录

中文摘要  5-7
前言  7-11
材料和方法  11-17
  1．试验材料  11
  2．方法  11-17
    2．1． Bt晶体杀虫蛋白抗原的提取及影响因素测定  11-13
      2．1．1．菌体培养  11
      2．1．2．孢晶混合物的提取  11
      2．1．3．伴孢晶体的提取  11-12
      2．1．4．晶体蛋白含量的测定  12
        2．1．4．1． 280nm／260nm吸收差法测定  12
        2．1．4．2．考马斯亮蓝G-250染色法测定  12
      2．1．5．伴孢晶体蛋白成分的电泳分析  12-13
    2．2． Bt杀虫蛋白抗体的制备  13-14
      2．2．1．注射用抗原的制备  13
      2．2．2．动物免疫和抗血清制备  13-14
      2．2．3．抗血清的分离和效价测定  14
      2．2．4．抗血清中免疫球蛋白（IgG）的提取  14
    2．3． ELISA间接法技术体系建立  14-17
      2．3．1．工作溶液  15
      2．3．2．棉叶中Bt杀虫蛋白的提取  15
      2．3．3． ELISA间接法操作程序  15
      2．3．4． Dot-ELISA的检测操作程序  15-16
      2．3．5．特异抗体类型处理对检测OD值的影响  16
      2．3．6．检测灵敏度的研究  16
      2．3．7．棉花样本Bt杀虫蛋白含量测定  16-17
结果及分析  17-36
  1． Bt晶体杀虫蛋白抗原的提取研究  17-22
    1．1．培养时间对Bt生长发育的影响  17-18
    1．2．培养时间对Bt晶体蛋白产量的影响  18-19
    1．3．提取方法对Bt晶体蛋白提取量的影响  19-20
    1．4．不同提取处理的蛋白质成分电泳分析  20-22
  2．抗体制备及提纯  22-25
    2．1．晶体杀虫蛋白含量测定  22-23
    2．2．免疫剂量对抗体产生的影响  23-25
    2．3．抗血清的IgG提取、含量和特异性测定  25
  3．检测方法研究  25-36
    3．1．特异抗体类型对光吸收值（OD）的影响  25-27
    3．2．检测灵敏度的测定  27-31
      3．2．1．用聚苯乙烯板进行ELISA间接法检测抗原的灵敏度  27-29
        3．2．1．1．采用IgG-HRP作为酶标抗体的检测灵敏度  27-28
        3．2．1．2．采用IgG-AP作为酶标抗体的检测灵敏度  28-29
      3．2．2． Dot-ELISA间接法检测的灵敏度  29-31
        3．2．2．1．采用IgG-HRP酶标抗体的Dot-ELISA检测灵敏度  30
        3．2．2．2．采用IgG-AP作为酶标抗体的Dot-ELISA检测灵敏度  30-31
    3．3．棉花样本中Bt杀虫蛋白的检测  31-36
      3．3．1．用ELISA间接法检测棉花样本中的Bt杀虫晶体蛋白含量  31-34
        3．3．1．1．采用IgG-HRP检测棉叶样本的Bt杀虫蛋白含量  31-32
        3．3．1．2．采用IgG-AP检测棉叶样本的Bt杀虫蛋白含量  32-34
      3．3．2 采用Dot-ELISA检测棉花样本中的Bt杀虫晶体蛋白含量  34-36
结论与讨论  36-38
致谢  38-39
英文摘要  39-41
参考文献  41-43

转Bt抗虫基因植物的酶联免疫检测技术研究

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