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色谱技术和伏安法在竹叶提取物成分分析中的应用研究

作　者: 徐维娅
导　师: 张英；吴晓琴
学　校: 浙江大学
专　业: 食品科学
关键词: 竹叶提取物碳苷黄酮微量元素高速逆流色谱(HSCCC) 制备型高效液相色谱(PHPLC) 液相色谱~质谱联用(LC~MS) 溶出伏安法
分类号: O629
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

目前竹叶提取物(Ehl₉₇₁)的主要质控指标是以硝酸铝～亚硝酸钠比色法测定的总黄酮糖苷含量（以芦丁为标准）。为了建立与国际接轨的高标准质控体系，必须运用高效液相色谱（HPLC）技术对Ebl₉₇₁中主要的黄酮碳苷进行定量，首先面临的是标准品的分离、纯化和结构鉴定。本研究采用高速逆流色谱（HSCCC）对Ebl₉₇₁中的黄酮进行组分分离，接着用制备型高效液相色谱（PHPLC）纯化黄酮单体，然后用液相色谱～质谱联用（LC～MS）技术对单体进行结构鉴定。同时采用溶出伏安法对Ebl9₉₇₁中的微量元素进行检测。研究结果分述如下： 1、经过对6组两相溶剂系统的分析测试，选择以石油醚：正丁醇：水（1：4：5）作为HSCCC的溶剂系统，其分层时间为25s，上下相体积比为0.96。两种主要竹叶碳苷黄酮在该溶剂系统上、下相中的分配系数分别为3.80和4.44。 2、以此溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相，当HSCCC仪转速为800rpm，流动相流速为2.25ml／min，Ebl₉₇₁进样量为103mg时，3小时内就可有效地将试样中的黄酮类化合物分成六个馏分，其中最主要的馏分—5号峰经HPLC检测，发现含两种主要的竹叶碳苷黄酮。 3、利用制备型反相高效液相色谱，对5号峰进一步分离纯化。色谱条件为：Beckman Ultrasphere TM ODS柱（10mm i.d．×250mm，5μm），柱温：30℃，流速：1.0ml／min，进样量：100μL，UV检测波长：330nm，PDA扫描波长范围：190～600nm，制备得到两个单体。其紫外光谱图都具有黄酮类化合物所特有的吸收带Ⅰ（300～400nm）和带Ⅱ（240～285nm），且两吸收峰的相对强度也符合黄酮类化合物特征。 4、利用LC～MS联用技术对所得的两个黄酮单体进行结构鉴定，测得其分子量均为448，带Ⅰ的紫外吸收相同，带Ⅱ有显著差异。经与美国Indofinechemical公司的HPLC级标准品对照，证实分别是荭草苷（8-C-葡萄糖-木犀草素）和异荭草苷（6-C-葡萄糖-木犀草素）。 5、经多次探索发现，运用1.5次微分的溶出伏安法，在0.01mol／L醋酸钠～0.045mol／L酒石酸氢钾介质（pH=5.78）中，镉、铅、锌和铜离子都能产生灵敏的氧化波，四种离子在10^-8-10^-6mol／L之间均具有良好的线性关系。将此法应浙江人学硕士学位论文徐维妞：色谱坟术和伏安法在竹叶提取物成分分伍中的应用研究用于 Ebl971中微量元素的分析测定，得干基含量为：铅二（．69士 0．057）pg冶，锌＝（6．09士0．567）k＊g；变异系数分别为3．38％和9．31％：回收率分别为84．7％～108％，锌85．2％～105％；而Ebl。，I中的铜和铜离子几乎狈不出。研究表明，将HSCCC和PHPLC有机绢合，可以从Ebl971中快速、高效地分离纯化黄酮单体，且能达到百毫克级的水平，为竹叶黄酮标准品的制备开拓了一条有效途径，并为竹叶提取物高标准质控体系的建立奠定了基础。同时，本研究得出的溶出伏安法测定竹叶提取物中的微量元素，具有样品处理简单、灵敏度高、快速简便。干扰小、设备投资省等优点，适宜在生产实际中推广使用。

全文目录

致谢  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
0 前言  12-22
  0．1 高速逆流色谱法在天然产物研究中的应用  12-14
  0．2 高效液相色谱法天然产物研究中的应用  14-17
  0．3 极谱和伏安法的应用  17-20
  0．4 立题的依据和意义  20-22
1 高速逆流色谱分离竹叶黄酮组分  22-32
  1．1 材料与方法  22-25
    1．1．1 实验材料  22-23
    1．1．2 仪器设备  23-24
    1．1．3 实验方法  24-25
      1．1．3．1 HSCCC分离溶剂系统的选择  24
      1．1．3．2 HSCCC操作程序  24
      1．1．3．3 HPLC分析方法  24-25
  1．2 结果与分析  25-31
    1．2．1 HSCCC分离的溶剂系统  25-26
    1．2．2 操作参数的优化  26-30
      1．2．2．1 色谱仪的转向  26-27
      1．2．2．2 进样量对分离效率的影响  27
      1．2．2．3 流动相流速对分离效率的影响  27
      1．2．2．4 仪器转速对分离效率的影响  27-30
    1．2．3 分离结果与分析  30-31
  1．3 小结  31-32
2 制备型高效液相色谱分离纯化竹叶碳苷黄酮单体  32-40
  2．1 材料与方法  32-34
    2．1．1 分离原料  32
    2．1．2 仪器与试剂  32
    2．1．3 实验方法  32-33
      2．1．3．1 HPLC分析条件  33
      2．1．3．2 HPLC制备条件  33
    2．1．4 馏分收集与制备  33
    2．1．5 HPLC-MS鉴定条件  33-34
  2．2 结果与分析  34-37
    2．2．1 色谱体系的选择  34-35
    2．2．2 流动相中酸的选择  35
    2．2．3 目标产物的纯度检验及结构确认  35-37
    2．2．4 HPLC-MS鉴定结构  37
  2．3 小结  37-40
3 溶出伏安法检测竹叶提取物（Ebl_（971））中的微量元素  40-53
  3．1 材料与方法  40-43
    3．1．1 实验材料  40
    3．1．2 仪器设备  40
    3．1．3 溶液的配制  40-41
    3．1．4 实验方法  41-42
    3．1．5 Ebl_（971）样品的消化  42
    3．1．6 Ebl_（971）样品的测定  42-43
  3．2 结果与分析  43-52
    3．2．1 测定体系的选择  43-45
      3．2．1．1 底液的选择  43
      3．2．1．2 pH值的选择  43-44
      3．2．1．3 镀汞膜的方法确定  44
      3．2．1．4 起始电位的选择  44
      3．2．1．5 富集时间与峰高的关系  44-45
      3．2．1．6 共存离子的影响  45
    3．2．2 各离子测定的线性范围和检测限  45-49
    3．2．3 样品的测定  49-51
    3．2．4 重现性和回收率试验  51-52
  3．3 小结  52-53
参考文献  53-58

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