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利用母血中胎儿有核红细胞进行无创性产前诊断的研究

作　者: 水丽君
导　师: 相文佩；熊承良
学　校: 华中科技大学
专　业: 妇产科学
关键词: 胎儿有核红细胞 密度梯度离心 SRY基因 PEP-PCR 荧光激活流式分选 多重PRINS 染色体检测 唐氏综合征 产前诊断
分类号: R714.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


第一部分妊娠妇女外周血中胎儿有核红细胞的富集实验一密度梯度离心结合显微分离富集母血中胎儿有核红细胞及PEP-PCR鉴定胎源性目的探讨单纯密度梯度离心结合显微操作富集母血中胎儿有核红细胞(FNRBCs)的可行性。方法采集40例妊娠妇女外周血,密度梯度离心法初步富集母血中胎儿有核红细胞并涂片,瑞氏染色后镜下观察,寻找阳性细胞并计数。以显微操作法挑取细胞,利用引物延伸预扩增( primer extension preamplification, PEP )及聚合酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR )检测Y染色体性别决定区( sex-determining region of Y-chromosome, SRY )。结果FNRBCs有典型形态特征,胞体较大,核圆,核仁消失,染色质成块状,胞浆丰富,清透。40例孕妇外周血中有31例可见阳性细胞,检出率77.5%。每例检出细胞1～8个,阳性细胞样本中平均检出3.55±1.73个/6 ml血样。PEP-PCR检测所获FNRBCs的SRY基因,阳性符合率76.5%(13/17),阴性符合率100%(14/14),性别总符合率87.1%(27/31)。结论母血中存在胎儿有核红细胞,其具有比较特殊的形态特点,利于辨认识别,无创性获取胎儿细胞的技术完全可行,同时为后续富集提供形态学依据。根据存在漏检和鉴定符合率不足分析,单纯密度梯度离心结合显微操作,存在很大主观性,对试验人员技术要求较高,技术上尚达不到理想推广程度。实验二流式细胞分选术富集母血中胎儿有核红细胞及PEP-PCR鉴定细胞胎源性目的探讨引入流式细胞术富集母血中胎儿有核红细胞(FNRBCs)的可行性,寻找富集FNRBCs的最适方法。方法采集15例正常妊娠妇女外周血,密度梯度离心后,采用FITC-CD71、PE-GPA两种单克隆抗体流式分选FNRBCs,PEP-PCR检测所得细胞SRY基因。结果分选后阳性细胞悬液滴片,荧光显微镜下观察荧光细胞,蓝色激发光下呈现绿色荧光,绿色激发光下可见同一位置FNRBC呈现红色荧光,瑞氏染色后符合FNRBCs形态学特点,细胞检出率100%(15/15),每例检出细胞3~9个,平均检出阳性细胞5.13±1.68个/6 ml血样。PEP-PCR检测所获FNRBCs的SRY基因,性别符合率100%。结论密度梯度离心结合流式分选可提高母血中胎儿有核红细胞检出率和显微操作成功率,为富集母血中胎儿细胞进行无创性产前诊断的有效方法。第二部分多重PRINS技术检测胎儿有核红细胞染色体目的探讨引物原位杂交PRINS作为快速检测胎儿细胞染色体方法的可行性。方法对分选阳性细胞滴片,采用FITC-12-dUTP、Texas red-12-dUTP标记,应用多重引物原位杂交(Primed in situ labeling, PRINS)技术检测细胞染色体:1.PRINS技术同时检测细胞X、Y染色体;2.PRINS技术同时检测细胞21号、Y染色体。结果1.女胎胎儿有核红细胞可观察到两个红色荧光信号(两个X染色体),男胎胎儿有核红细胞可观察到红色和绿色荧光信号各一个(代表一条X染色体和一条Y染色体;2.女胎胎儿有核红细胞可观察到两个绿色荧光信号(代表两个21染色体)而没有红色荧光信号(代表Y染色体),男胎胎儿有核红细胞可观察到两个绿色荧光信号和一个红色荧光信号(代表两个21染色体和一个Y染色体);6例标本检测结果和实际胎儿核型符合,敏感性和特异性均为100%。结论PRINS技术可有效、准确的检测细胞染色体,经济,快速,结果直观;多重PRINS可同时检测不同染色体,可以作为产前诊断染色体异常的一种比较理想的方法第三部分快速无创性产前诊断唐氏综合征模式拟建及验证目的建立快速无创性产前诊断唐氏综合征有效诊断模式方法拟建模式图,并进行具体实施验证:早中孕妇90名,采取血清三联筛查结合B超和病史选取唐氏高危孕妇8名,当日密度梯度离心结合流式分选富集母血中FNRBCs,次日多重PRINS技术检测细胞21号及Y染色体。结果均可在两日内得到诊断结论:7例正常胎儿,包括男胎2例、女胎5例;诊断男性唐氏患儿一例,PRINS结果可在细胞里观察到三条21染色体和一条Y染色体。8例标本检测结果和实际胎儿核型符合。结论密度梯度离心结合流式分选母血中胎儿细胞,PRINS检测细胞染色体,可作为快速无创性产前诊断胎儿唐氏综合征的有效模式,并可为其他胎儿染色体基因异常或者宫内感染的无创性产前诊断提供参考。

全文目录


英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
引言  13-18
第一部分 妊娠妇女外周血中胎儿有核红细胞的富集  18-35
  实验一 密度梯度离心结合显微分离富集母血中胎儿有核红细胞及PEP-PCR鉴定胎源性  18-26
    材料和方法  18-20
    结果  20-26
  实验二 流式细胞分选术富集母血中胎儿有核红细胞及PEP-PCR 鉴定胎源性  26-31
    材料和方法  26-28
    结果  28-31
  讨论  31-34
  参考文献  34-35
第二部分 多重引物原位杂交PRINS 检测胎儿有核红细胞染色体  35-41
  材料和方法  35-37
  结果  37-38
  讨论  38-40
  参考文献  40-41
第三部分 快速无创性产前诊断唐氏综合征模式拟建及验证  41-48
  材料和方法  43-44
  结果  44
  讨论  44-47
  参考文献  47-48
综述  48-58
  参考文献  55-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 产科学 > 胎儿
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