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毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的构建及表达分析

作　者: 杨国峰
导　师: 周鹏
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: hGM－CSF 毕赤氏酵母 载体构建 转化 表达
分类号: Q93-331
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
下　载: 76次
引　用: 4次
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内容摘要


本研究利用初步改造的hGM-CSF基因构建了PGAPZα-A/hGM-CSF重组分泌型表达载体，将其转入毕赤氏酵母SMD1168菌株和GS115菌株，得到了整合有hGM-CSF基因的工程菌。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选得到了1号、2号和6号三个表达较好的工程菌，根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质相对分子量的方法测得1号、2号和6号电泳样品中主带蛋白质的相对分子量分别为的15.135kD、14.791kD和14.454kD，与文献报道的hGM-CSF的相对分子量（14.4kD）的差在±10％以内，说明主带蛋白质可能是hGM-CSF。利用Folin-酚试剂法测得1号、2号和6号工程菌发酵液上清中的蛋白质总浓度分别为46.5μg/mL、54.7μg/mL和46.5μg/mL，用薄层扫描仪分析染色后的聚丙烯酰胺凝胶得到了1号、2号和6号样品中主带蛋白质在其蛋白质总量中所占的比例，分别为47.002％、45.731％和51.166％，计算得到了1号、2号和6号工程菌中主带蛋白质的表达量分别为1.093μg/mL、1.251μg/mL和1.190μg/mL。TF-1依赖细胞株/MTT比色法检测活性的结果表明1号、2号和6号工程菌分泌表达的蛋白质具有天然hGM-CSF的生物活性，活性单位分别为1.14×10~4U/mL、1.11×10~4U/mL和1.23×10~4U/mL，比活性分别为1.043×10~7U/mg、0.887×10~7U/mg和1.034×10~7U/mg，与文献报道的hGM-CSF的比活性（0.8～1.1×10~7U/mg）相符，初步确定主带蛋白质是hGM-CSF。本研究初步验证了毕赤氏酵母表达hGM-CSF的可行性，在hGM-CSF的商业化生产和临床应用方面具有重要的理论和应用价值。

全文目录


中文摘要  4-5
前言  5-17
  1．1 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）  5-12
  1．2 巴斯德毕赤氏酵母表达系统  12-17
2 材料与方法  17-30
  2．1 材料  17
  2．2 毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的构建  17-24
    2．2．1 pGAPZα-A/hGM-CSF重组载体的构建  17-21
      2．2．1．1 hGM-CSF基因片段的制备  17-18
      2．2．1．2 线性化pGAPZα-A载体的制备  18
      2．2．1．3 线性化载体与hGM-CSF基因片段的连接  18-19
      2．2．1．4 pGAPZα-A/hGM-CSF重组载体的鉴定  19-21
    2．2．2 PGAPZα-A/hGM-CSF重组载体转化毕赤氏酵母及工程菌的鉴定  21-24
      2．2．2．1 重组载体的线性化  21
      2．2．2．2 毕赤氏酵母感受态细胞的制备  21-22
      2．2．2．3 酵母的转化  22
      2．2．2．4 毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的斑点杂交检测  22-24
  2．3 毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的表达分析  24-30
    2．3．1 工程菌分泌表达蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  24-28
      2．3．1．1 所需试剂的配制  24-25
      2．3．1．2 蛋白质样品的制备  25-26
      2．3．1．3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳  26-27
      2．3．1．4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的电泳后染色  27
      2．3．1．5 工程菌主带蛋白质相对分子量的测定  27-28
      2．3．1．6 工程菌主带蛋白质表达量的测定  28
    2．3．2 工程菌分泌表达蛋白质的活性检测  28-30
      2．3．2．1 所需试剂的配制  28-29
      2．3．2．2 活性检测  29-30
3 结果与分析  30-33
  3．1 毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的构建结果  30
    3．1．1 pGAPZα-A/hGM-CSF重组载体的构建结果  30
    3．1．2 pGAPZα-A/hGM-CSF重组载体转化毕赤氏酵母及工程菌的鉴定结果  30
  3．2 毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的表达分析结果  30-33
    3．2．1 工程菌分泌表达蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果  30-32
      3．2．1．1 工程菌主带蛋白质相对分子量的测定结果  30-31
      3．2．1．2 工程菌主带蛋白质表达量的测定结果  31-32
    3．2．2 工程菌分泌表达蛋白质的活性检测结果  32-33
4 讨论  33-36
  4．1 hGM-CSF在毕赤氏酵母中成功表达的意义  33-34
  4．2 进一步提高毕赤氏酵母中hGM-CSF表达量的设想  34-36
附图  36-43
参考文献  43-46
英文摘要  46-47
致谢  47

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