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发根农杆菌介导桑遗传转化体系的建立及槲皮素在发根中的含量测定

作　者: 李想韵
导　师: 孙敏
学　校: 西南大学
专　业: 植物学
关键词: 桑组织培养遗传转化植物次生代谢工程槲皮素
分类号: S888
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

桑(Morus alba L.)是桑科(Moraceae)桑属(Morus)多年生木本双子叶植物。我国是世界上桑树资源最为丰富的国家,桑作为药用植物已有很长的历史。桑树全身是宝,其果实(桑葚)、根、茎、叶及其加工副产物都具有很高的药用价值和保健价值。桑叶中富含人体所需的18种氨基酸,其中8种是人体所必需的,桑叶中还含有槲皮素、超氧化物歧化酶、葫芦巴碱、多糖等特殊的功能性成分；桑枝是种很好的中药材,其中所含的黄酮类化合物具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗衰老、预防肿瘤等功能,在农业、化工医药等领域有着非常重要的应用价值。桑根(俗称桑白皮)具有显著的降血压作用和一定的抗HIV活性。而采用正交设计的方法筛选和建立桑的无菌快繁体系,目前还未见报道。桑科植物主要的药用化学成分为黄酮类(flavone)化合物,其中槲皮素(quercetin)具有抗炎、抗肿瘤、抗血小板聚集、扩张冠动脉等等作用。发根农杆菌是一种侵染性很强的细菌,在植物基因工程中,其介导的基因转移系统已比较完善,发根农杆菌含有Ri质粒,在Vir基因胁迫下,T-DNA能够整合到植物核基因组中,诱导宿主植物体产生毛状根(hairy root) [9],利用毛状根生长速度快、分支多,并能够持续合成次生代谢产物等显著特点,利用其来生产植物次生代谢产物中的药用活性成分,已有不少报道。而利用农杆菌对桑科植物进行遗传转化、利用桑毛状根来生产药用活性成分,目前还未见报道。本文旨在探讨不同激素和不同培养基的组合对桑茎段诱导出芽、进行芽增殖以及生根培养的影响,以期快速筛选出最佳的芽诱导、芽增殖和生根的培养基与激素的组合,为进一步开展桑的遗传转化工作奠定基础。利用卸甲型发根农杆菌C58C1侵染桑的无菌黄化苗,从黄化苗幼茎中诱导出毛状根,建立桑科毛状根诱导与离体培养的体系,并对桑毛状根中的槲皮素进行含量测定,旨在提高桑原植株黄酮类含量,为今后利用遗传转化对药用植物活性成分进行工业化生产奠定基础。本研究以桑种子萌发的无菌黄化苗为材料,通过正交试验的方法建立桑的离体培养体系,采用经改造后的发根农杆菌诱导桑毛状根,并运用高效液相色谱(HPLC)技术对毛状根中槲皮素进行含量测定与分析。本文主要的研究内容及结果如下：1.桑的离体培养及植株再生：采用正交设计的方法,用MS作基本培养基,研究了不同的表面消毒方法对桑不同外植体离体培养污染率控制的影响。利用L,(34)正交设计的方法探讨不同培养基种类和激素配比对桑茎段丛生芽诱导效率的影响,并对影响其外植体生根的主要因子进行研究。结果表明：以桑侧枝带芽茎段为材料,采用70%酒精消毒30s,0.1%升汞2次消毒5 min和6 min,并向培养基中添加100 mg／L的氨苄青霉素(Amp)或头孢霉素(Cef),能有效地将污染率控制到零。A2B2C1组合为出芽诱导最佳培养基与激素的组合,此培养基还可同时实现芽增殖。适合生根的培养基为WPM+1.0mg／LIBA。2.桑遗传转化体系的建立及其条件优化：利用卸甲型根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciensC58C1侵染桑的无菌黄化苗,建立毛状根的诱导与培养体系；优化毛状根的扩大培养条件并测定其生长曲线,对桑毛状根T-DNA转化结果进行PCR检测；结果表明：用C58C1侵染无菌苗外植体,侵染10 min,分别预、共培养2 d及添加质量浓度为100mg·L-1的乙酰丁香酮(AS)可得最高转化率；PCR检测结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolB、rolC基因片段已整合入桑的毛状根基因组中；C58C1侵染桑黄化无菌苗茎段10 d后,茎段伤口处陆续产生毛状根,30 d后幼茎上产生毛状根的外植体达92%。3.桑毛状根槲皮素含量测定：将桑毛状根培养在1／2MS+0.05 mg·L-1 IBA液体培养基中50 d后,利用RP-HPLC检测其中的槲皮素含量；结果表明,毛状根中槲皮素的含量比原植株增加了8.5倍。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
第1章文献综述  8-26
  1.1 植物组织培养技术  8-10
  1.2 植物次生代谢工程  10-14
  1.3 植物遗传转化技术  14-17
  1.4 药用植物毛状根的诱导及培养技术  17-21
  1.5 植物生物技术在桑科植物研究中的应用  21-23
  1.6 槲皮素类药物的作用机理及研究进展  23-26
第2章引言  26-28
  2.1 研究背景  26
  2.2 研究目的和意义  26-27
  2.3 技术路线  27-28
第3章桑的离体培养及植株再生  28-36
  3.1 材料与试剂  28
  3.2 实验方法  28-30
  3.3 结果与分析  30-35
  3.4 讨论  35-36
第4章桑遗传转化体系的建立  36-42
  4.1 材料与试剂  36
  4.2 实验方法  36-38
  4.3 结果与分析  38-40
  4.4 讨论  40-42
第5章槲皮素的提取及含量测定  42-46
  5.1 材料与方法  42
  5.2 实验方法  42-43
  5.3 结果与分析  43-45
  5.4 讨论  45-46
结论  46-48
参考文献  48-54
附录  54-56
致谢  56-57
在学期间发表的文章  57

发根农杆菌介导桑遗传转化体系的建立及槲皮素在发根中的含量测定

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