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黑麂（Muntiacus crinifrons）AFLP-SCAR种特异性探针研制

作　者: 梁文明
导　师: 吴海龙
学　校: 安徽师范大学
专　业: 动物学
关键词: 黑麂 扩增片段长度多态性 序列特征性扩增区域 物种鉴定
分类号: S865
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


黑麂(Muntiacus crinifrons)是我国特有的濒危鹿科动物,具有很高的学术研究价值。由于分布范围狭窄,加之传统狩猎习俗和经济价值等因素,该物种长期遭受非法捕猎的生存压力,野生种群数量已十分稀少,因而,黑麂被列为国家一级重点保护野生动物。尽管如此,野外盗猎现象仍时有发生,出售在市场上的黑麂被去皮后,执法人员几乎无法利用形态学特征等宏观手段进行鉴定。为了切实保护黑麂,为相关执法部门提供一种便捷、可靠、高效的工具来鉴定黑麂组织样品,本研究基于AFLP方法开发了黑麂种特异性SCAR探针。首先,利用引物Ep7和Mp8获得了长度为707bp的黑麂AFLP特异性条带,对该特异性DNA片段进行纯化、克隆、测序。根据所测DNA片段序列信息,利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计了黑麂特异引物(P-F/P1-R),并获得了长度为298bp的SCAR。为了检测特异引物的可靠性,对引物进行了群体扩增检测。同时,利用哺乳动物cyt b通用引物L1和H1对所有待检样品DNA的质量进行了检测。结果显示,在全部9种43个个体样品中,25个黑麂样品全部扩增出2条目标条带,即长度298bp的黑麂特异条带和长度约为466bp的cyt b基因片段;而代表其它物种的18个个体均仅扩增出单一的cyt b基因片段。所有个体都能被哺乳动物cyt b通用引物扩增,说明待检样品DNA的质量全部符合PCR扩增要求,引物可靠性检测结果达到对目标动物进行法医学鉴定的目的。综上所述:本研究已成功地将黑麂种特异性AFLP标记转化为SCAR标记,并得到了具有高度物种特异性的SCAR探针。利用本研究开发的SCAR特异探针,只要根据黑麂特异条带的有或无,就能快速、准确地鉴别出黑麂。因此,该探针可作为执法部门鉴定黑麂组织样品的有效工具,以加强对偷猎行为的执法力度。此外,利用该探针可以基于无损伤取样法(如粪便)对特定区域黑麂野生种群动态进行监测。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章 研究背景  10-21
  第一节 黑麂研究现状  10-14
    1. 生物学与种群生态学方面的研究  10-12
    2. 保护遗传学方面的研究  12-13
    3. 黑麂的生存现状  13-14
  第二节 AFLP、SCAR 及其在物种鉴定方面的应用  14-19
    1.A FLP 标记技术  14
    2.A FLP 特点及其在物种鉴定方面的应用  14-15
    3. SCAR 标记技术  15-16
    4. SCAR 在物种鉴定方面的应用  16-18
    5. AFLP-SCAR 复合分子标记相关研究进展  18-19
  第三节 研究的目的和意义  19-21
第二章 黑麂AFLP-SCAR 种特异性探针制备  21-50
  第一节 材料与方法  21-37
    1. 实验材料  21-22
      1.1 样品  21
      1.2 主要试剂和仪器设备  21-22
    2. 实验方法  22-37
      2.1 基因组DNA 提取  22-23
        2.1.1 皮张DNA 提取  22-23
        2.1.2 血液DNA 提取  23
      2.2 AFLP 分析  23-31
        2.2.1 基因组DNA 的双酶切  24-25
        2.2.2 酶切片段的连接反应  25-26
        2.2.3 预扩增  26-27
        2.2.4 选择性扩增  27-28
        2.2.5 黑麂种特异性标记的筛选  28-31
      2.3 SCAR 分析  31-36
        2.3.1 黑麂种特异性AFLP 条带的回收  31-32
        2.3.2 PAGE 回收产物的PCR 扩增  32
        2.3.3 PCR 产物的纯化  32-33
        2.3.4 连接  33
        2.3.5 转化  33-34
        2.3.6 筛选阳性克隆  34
        2.3.7 阳性克隆测序  34-35
        2.3.8 SCAR 引物的设计与检测  35-36
      2.4 多重PCR 检测  36-37
  第二节 实验结果  37-44
    1. 利用AFLP 技术获得黑麂种特异性标记  37-40
      1.1 基因组DNA 检测结果  37-38
      1.2 DNA 双酶切产物检测结果  38
      1.3 连接产物检测结果  38-39
      1.4 预扩增检测结果  39
      1.5 选择性扩增检测结果  39-40
      1.6 选扩产物的变性PAGE 检测结果  40
    2. 利用SCAR 技术制备黑麂种特异性探针  40-44
      2.1 PAGE 回收产物的PCR 扩增结果  40-41
      2.2 纯化PCR 产物的检测结果  41-42
      2.3 黑麂特异条带克隆的检测结果  42
      2.4 克隆样品的测序结果  42-43
      2.5 黑麂特异引物的群体扩增检测结果  43-44
      2.6 多重PCR 检测结果  44
  第三节 讨论  44-50
    1. 利用AFLP 技术筛选目标条带过程中的几个问题  44-48
      1.1 基因组DNA 的质量  44-45
      1.2 酶切程度  45-46
      1.3 预扩增  46
      1.4 选择扩增  46-47
      1.5 变性PAGE 检测  47
      1.6 银染  47-48
    2. 分子鉴定中遗传标记的选择  48-49
    3. SCAR 标记在皖南野生动物管理中的应用  49-50
第三章 参考文献  50-55
致谢  55-56
附录Ⅰ基金项目  56
附录Ⅱ攻读硕士学位期间发表的学术论文  56

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 狩猎、野生动物驯养 > 各种野生动物驯养
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