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柳蚕丝素重链基因的克隆和表达分析

作　者: 曹甲
导　师: 刘朝良
学　校: 安徽农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 柳蚕丝素重链基因克隆半定量PCR
分类号: S885.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蚕丝由丝胶和丝素两部分组成。丝胶主要是由中部丝腺合成,约占重量的25 %,包裹着丝素蛋白。丝素蛋白主要是在后部丝腺合成,是蚕丝中主要的组成部分,约占重量的70%。丝素重链(Fib-H)作为丝素蛋白中主要的组成部分,与丝素轻链(Fib-L)和P25蛋白以6∶6∶1的摩尔比组成复合体,构成丝素的基本结构单位。研究丝素重链对于提高蚕丝的产量和质量、生产有特殊用途的丝产品、提高蚕的抗病能力和抵抗不良环境的能力以及弄清物种之间的同源性与进化关系等方面具有重要的理论和实际应用价值。本研究利用反转录PCR的方法首次在柳蚕丝腺中获得了Fib-H基因的5’端序列,片段长2801bp,编码933个氨基酸,包含起始密码子ATG,具有野蚕Fib-H保守结构特征,经过与柞蚕、天蚕、樟蚕、印度柞蚕等昆虫的丝素基因对比,发现有高度的同源性,尤其与同为大蚕蛾科的樟蚕的关系最近。GenBank登录号:GU212855.1。利用半定量PCR对五龄期不同时间Fib-H基因的表达情况进行分析,结果表明:柳蚕幼虫5龄期第1日、第3日、第6日、第9日、第12日的后部丝腺中,Fib-H基因的表达量呈逐渐增加的趋势,与丝腺发育的生理特征相符合。通过对五龄期第1日、第3日、第6日、第9日、第12日中部丝腺、脂肪体等不同组织Fib-H基因的表达情况进行分析,发现Fib-H基因在中部丝腺中也存在一定程度的表达,且变化趋势大致是:低—高—低-高。脂肪体中未检测到该基因表达,表明Fib-H基因的表达具有组织特异性,这与早期的关于Fib-H基因的研究结果基本是一致的。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-6
1 文献综述  6-11
  1. 概述  6-9
    1.1 蚕丝蛋白的合成、分泌及结构特点  6-7
    1.2 蚕丝素重链基因国内外研究进展  7-9
  2. 柳蚕丝素重链基因的研究意义  9-10
  3. 柳蚕丝素重链基因研究的基本技术路线  10-11
2 材料和方法  11-17
  2.1 柳蚕丝素重链（Fib-H）基因的克隆与序列分析  11-16
    2.1.1 供试材料  11
    2.1.2 主要的仪器设备  11
    2.1.3 主要生化试剂及常用溶液的配制  11-12
    2.1.4 柳蚕丝腺的收集  12-13
    2.1.5 柳蚕丝素总 RNA 的提取  13
    2.1.6 总RNA 的检测  13
    2.1.7 柳蚕丝素重链（Fib-H）基因cDNA 第一链的合成  13-14
    2.1.8 PCR 成分及程序  14
    2.1.9 PCR 产物的纯化（参见上海生工产品说明书）  14-15
    2.1.10 感受态细胞的制备  15
    2.1.11 连接和转化  15
    2.1.12 测序  15
    2.1.13 序列拼接与分析  15-16
  2.2 半定量 PCR 检测柳蚕丝素重链（Fib-H）基因的表达  16-17
    2.2.1 五龄幼虫期丝腺、脂肪体的收集  16
    2.2.2 总RNA 的抽提  16
    2.2.3 cDNA 第一链的合成  16
    2.2.4 内参引物的设计以及Fib-H 引物的选择  16
    2.2.5 PCR 反应成分  16-17
3 结果与分析  17-31
  3.1 丝腺总 RNA 的提取  17
  3.2 PCR 扩增结果分析  17-18
  3.3 柳蚕Fib-H 序列的同源性分析以及进化关系  18-19
  3.4 柳蚕丝素重链基因（Fib-H）序列分析  19-29
  3.5 五龄不同时期柳蚕丝素重链基因（Fib-H）表达情况分析  29-30
  3.6 五龄不同组织柳蚕丝素重链基因（Fib-H）表达情况分析  30-31
4 讨论  31-32
5 结论  32-33
参考文献  33-38
致谢  38-39
个人简介  39

柳蚕丝素重链基因的克隆和表达分析

内容摘要

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