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蚓激酶基因在毕赤酵母中的表达

作　者: 张成瑶
导　师: 王罡
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 蚓激酶 毕赤酵母 表达 抗血栓
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


蚓激酶(Lumbrokinase,LK)是从蚯蚓体内提取的一种具有纤溶活性的蛋白水解酶,它能直接降解血中纤维蛋白原及激活纤溶酶原为纤溶酶。蚓激酶能降低血液粘稠度、溶栓、减少血小板聚集、改善微循环,具有良好的体内外溶栓抗凝作用。作为溶栓药物,蚓激酶先后在韩国和中国上市,在心脑血管疾病治疗中显示出明显的疗效。毕赤酵母是目前应用最为广泛和成功的外源蛋白表达系统,其培养条件简单易行、容易形成大规模生产;表达产物经过二硫键形成、正确折叠、糖基化及信号处理等修饰,使其特性接近天然产物。鉴于上述原因,毕赤酵母表达系统成为开发蛋白类基因工程药物的首选。本实验目的是获得能够表达蚓激酶的基因工程酵母菌株。通过PCR扩增目的基因,将其连接到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,得到目的基因表达载体。载体经线性化后,电击转入毕赤酵母GS115中,经过组氨酸营养缺陷平板筛选及G418筛选,得到一系列转化子。经PCR验证,目的基因已经转入酵母体内。Northern dot blotting检测目的基因已在酵母体内转录。将得到的转化子在甲醇营养限制平板筛选,得到的转化子鉴定为甲醇利用缓慢型Muts。经诱导后的发酵液可以溶解血纤维蛋白平板。本实验为基因工程生产蚓激酶的中上游工作提供良好的理论支持,为下一步大规模发酵打下基础。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章 文献综述  8-20
  1.1 毕赤酵母表达系统研究进展  8-15
    1.1.1 背景概述  8-9
    1.1.2 毕赤酵母的甲醇代谢  9
    1.1.3 毕赤酵母表达体系  9-10
    1.1.4 选择标记  10
    1.1.5 蛋白降解酶的控制  10-13
    1.1.6 基因剂量  13
    1.1.7 重组蛋白翻译后的修饰  13-15
  1.2 蚓激酶研究进展  15-19
    1.2.1 概述  15-16
    1.2.2 蚓激酶的生理学特征  16-17
    1.2.3 蚓激酶的临床应用  17-18
    1.2.4 蚓激酶的基因工程重组  18-19
  1.3 本文研究内容与意义  19-20
    1.3.1 研究内容  19
    1.3.2 研究意义  19-20
第二章 毕赤酵母表达载体的构建  20-27
  2.1 实验准备  20-21
    2.1.1 材料  20
    2.1.2 试剂与培养基  20-21
    2.1.3 主要仪器  21
  2.2 实验方法  21-25
    2.2.1 引物设计  21-22
    2.2.2 质粒的提取  22
    2.2.3 PCR扩增目的基因  22-23
    2.2.4 PCR产物连接到载体  23-24
    2.2.5 转化大肠杆菌扩增表达载体  24
    2.2.6 表达载体的酶切验证  24-25
  2.3 结果与分析  25-27
    2.3.1 PCR扩增目的基因  25
    2.3.2 表达载体的酶切验证  25-27
第三章 毕赤酵母的电击转化与筛选  27-37
  3.1 实验准备  27-29
    3.1.1 材料  27
    3.1.2 试剂及培养基  27-28
    3.1.3 主要仪器  28-29
  3.2 实验方法  29-34
    3.2.1 毕赤酵母的电击转化  29
    3.2.2 转化子的筛选  29-30
    3.2.3 酵母菌落PCR筛选阳性克隆  30
    3.2.4 毕赤酵母总RNA提取  30-31
    3.2.5 Northern Dot Blotting  31-34
  3.3 结果讨论  34-37
    3.3.1 毕赤酵母的转化  34
    3.3.2 菌落PCR筛选效果  34-35
    3.3.3 毕赤酵母总RNA提取  35-36
    3.3.4 Northern dot blotting  36-37
第四章 蚓激酶在毕赤酵母中的表达及产物检测  37-44
  4.1 实验准备  37-38
    4.1.1 试剂与培养基  37-38
    4.1.2 主要仪器  38
  4.2 实验方法  38-41
    4.2.1 甲醇利用表型的检测  38
    4.2.2 Muts的分泌表达  38-39
    4.2.3 发酵上清液中蛋白的提取  39
    4.2.4 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳  39-40
    4.2.5 纤维蛋白平板检验生物活性  40-41
  4.3 实验结果与分析  41-44
    4.3.1 甲醇利用表型的检测  41
    4.3.2 SDS-PAGE蛋白电泳结果  41-42
    4.3.3 纤维蛋白平板溶圈分析  42-44
第五章 结论  44-45
参考文献  45-50
发表论文和参加科研情况说明  50-51
致谢  51

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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