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利用扣囊复膜酵母菌A11菌株转化木薯淀粉生产海藻糖的研究

作　者: 张颖
导　师: 池振明
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 扣囊复膜酵母A11 海藻糖木薯淀粉发酵诱变
分类号: TQ281
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

海藻糖(Trehalose)广泛存在于微生物、无脊椎动物、脊椎动物和植物中。研究显示海藻糖不仅可以作为细胞碳源储存物,还可用作高效保护剂增加细胞组分对不良环境条件(如高温、饥饿、冷冻、脱水、辐射、有毒试剂、高渗透压和高酒精浓度)的抗性。海藻糖不仅可以在生物体内起作用,而且外加的海藻糖同样可以对生物大分子具有保护作用,这使其在很多方面具有广泛的应用,如在医学、分子生物学和微生物学中作为细胞防冻剂、化妆品的有效成分、诊断试剂和生物产品的稳定剂,以及用作新鲜食品的保鲜剂。因此,用廉价高效的的方法生产海藻糖已成为当前研究热点。淀粉价格低廉,来源广泛,以淀粉为原料,酶法制备海藻糖,起始物价格便宜,转化率高,很有应用前景,被认为是用来生产海藻糖的最佳原料。我们在过去的研究中也发现Saccharomycopsis fibuligera sdu是利用淀粉来转化生产海藻糖的很好菌株。但该酵母菌体内能合成酸性和中性海藻糖酶,这些酶在细胞中可以分解合成的海藻糖,这将不利于海藻糖的累积。因此,为了提高海藻糖的产量,从该菌株中去除或降低酸性和中性海藻糖酶活力是必要的。后来,利用化学诱变技术获得酸性和中性海藻糖酶活力大大降低的A11突变株,该突变株在可溶性淀粉培养基中培养菌体内海藻糖的累积量达到19.1%(w／w),在玉米淀粉培养基中培养菌体内海藻糖的累积量达到24.0%(w／w)。本研究发现用木薯淀粉代替玉米淀粉来生产海藻糖能使海藻糖的生产成本更低,A11突变株在2.0%(w／v)木薯淀粉培养基2-L发酵罐中发酵48 h菌体内海藻糖的累积量达到25.8%(w／w)。使用可溶性淀粉和玉米淀粉作为碳源来转化海藻糖是不经济的。木薯作为一种非粮作物,被用来当做食品和发酵工业的淀粉材料,在中国南方很多省市大范围种植。研究中,我们发现在摇瓶试验中,A11菌株利用木薯淀粉转化海藻糖量高于可溶性淀粉、玉米淀粉等。且在2.0%木薯淀粉、4.0%豆饼粉水解液、pH 5.5·和30℃条件下培养48 h,海藻糖累积量达24.8%(w／w)。本论文还利用2-L全自动发酵罐研究该菌株发酵木薯淀粉生产海藻糖,A11菌株48 h发酵罐中海藻糖积累量为25.8%,残留还原糖浓度和残留总糖浓度分别为1.2 mg/mL和2.1 mg/mL。这是目前所报道的海藻糖积累量最高的菌株。在海藻糖提取精制工艺方面,本论文主要用了三氯乙酸和乙醇沉淀法提取菌体中的海藻糖,提取液经过进一步分离纯化,得到海藻糖晶体。针对目前海藻糖的提取方法都存在不足,本研究用化学诱变方法得到突变株A83,该菌株在37℃条件下细胞壁通透性发生变化能够自动释放海藻糖,且海藻糖释放率达到44.7%。此研究是在目前环境污染、资源消耗形势严峻的社会背景下,为响应节能环保的号召以及为低成本无毒性的海藻糖的工业生产做出了积极的探索和尝试。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章综述  13-35
  1 海藻糖的理化性质及来源  13-15
  2 海藻糖的生物学特性及作用  15-20
    2.1 海藻糖的生物学特性  15-16
    2.2 海藻糖对生物抗脱水保护作用  16-17
    2.3 海藻糖抗冷冻保护作用  17
    2.4 海藻糖提高耐热性作用  17
    2.5 海藻糖抗高渗保护作用  17-18
    2.6 海藻糖的抗辐射作用  18-19
    2.7 稳定生物膜和蛋白质结构  19
    2.8 其它作用  19-20
  3 海藻糖保护作用机制  20-22
    3.1 “水替代”假说  20-21
    3.2 “玻璃态”假说  21
    3.3 “优先排阻”假说  21-22
    3.4 “化学稳态”假说  22
  4 海藻糖的生产方法  22-29
    4.1 微生物抽提法  22-23
    4.2 微生物发酵法  23
    4.3 酶法生产  23-28
      4.3.1 以葡萄糖为底物合成海藻糖  23-25
      4.3.2 以麦芽糖为底物合成海藻糖  25
      4.3.3 以淀粉为底物合成海藻糖  25-27
      4.3.4 以蔗糖为底物合成海藻糖  27-28
    4.4 基因重组法  28-29
    4.5 化学合成法  29
  5 海藻糖的应用领域  29-33
    5.1 食品方面  29-30
    5.2 医学保健方面  30-31
    5.3 农业方面  31
    5.4 精细化工方面  31-32
    5.5 科学研究方面  32-33
  6 论文选题背景及研究意义  33-35
第二章扣囊复膜酵母突变菌株A11菌株转化木薯淀粉生产海藻糖的摇瓶试验  35-47
  1 材料  35-36
    1.1 菌株  35
    1.2 培养基  35-36
  2 方法  36-39
    2.1 豆饼粉水解液的制备  36
    2.2 A11菌株积累海藻糖的最佳培养基的确定  36
    2.3 A11菌株积累海藻糖的最佳培养基浓度确定  36-37
    2.4 A11菌株积累海藻糖的最佳培养pH确定  37
    2.5 A11菌株积累海藻糖的最佳培养温度确定  37
    2.6 海藻糖的提取和定量测定  37-38
      2.6.1 75%浓硫酸配制  37-38
      2.6.2 蒽酮溶液配制  38
      2.6.3 海藻糖标准曲线的制作  38
    2.7 细胞生长量的测定  38-39
    2.8 还原糖浓度的测定  39
    2.9 总糖浓度的定量测定  39
  3 结果与讨论  39-46
    3.1 不同淀粉对A11菌株累积海藻糖和生长的影响  39-40
    3.2 不同木薯淀粉浓度对A11菌株累积海藻糖和菌体生长的影响  40-41
    3.3 发酵培养基中还原糖浓度和总糖浓度的比较  41-42
    3.4 不同pH对A11菌株海藻糖积累量和菌体生长情况的影响  42-43
    3.5 A11在不同pH值下发酵培养基还原糖浓度和总糖浓度比较  43-44
    3.6 温度对A11菌株海藻糖累积和菌体生长的影响  44-45
    3.7 在不同温度下发酵培养基还原糖浓度和总糖浓度比较  45-46
  4. 本章小结  46-47
第三章 2L发酵罐实验与海藻糖提取工艺  47-56
  1.材料  47-48
    1.1 菌株  47
    1.2 培养基  47-48
    1.3 发酵罐  48
  2.材料和方法  48-50
    2.1 材料  48
    2.2 方法  48-50
      2.2.1 海藻糖积累量、菌体干重、还原糖含量和总糖含量测定  48-49
      2.2.2 海藻糖粗制品的制备  49
      2.2.3 海藻糖的纯化  49-50
      2.2.4 海藻糖的纯度鉴定  50
      2.2.5 HPLC分析  50
      2.2.6 海藻糖结晶品  50
  3 结果与讨论  50-55
    3.1 在2L发酵罐中A11菌株海藻糖积累和菌体生长情况  50-51
    3.2 发酵过程中还原糖和总糖含量的变化  51-52
    3.3 海藻糖柱层析图  52-53
    3.4 紫外扫描结果  53
    3.5 HPLC分析结果  53-54
    3.6 海藻糖结晶品  54-55
  4 本章小结  55-56
第四章扣囊复膜酵母A11细胞通透性突变株的筛选  56-64
  1 材料与方法  56-59
    1.1 材料  56-57
      1.1.1 菌株  56-57
      1.1.2 试剂  57
      1.1.3 培养基  57
    1.2 方法  57-59
      1.2.1 亚硝基胍诱变致死率的确定  57-58
      1.2.2.温度敏感突变株的筛选  58
      1.2.3 液体发酵筛选  58-59
      1.2.4 突变株A11-83与出发菌株的细胞菌落形态比较  59
      1.2.5 突变株A11-83与出发菌株生长量和海藻糖含量比较  59
      1.2.6 海藻糖释放率的计算  59
  2. 结果与分析  59-63
    2.1 致死率的确定  59-60
    2.2 突变株海藻糖释放率比较  60-61
    2.3 细胞通透性发生变化的菌株其菌落照片  61
    2.4 突变株A11-83与原始菌株A11的形态比较  61-62
    2.5 突变株A11-83与出发菌株A11生长量与海藻糖积累量比较  62-63
  3 本章小结  63-64
总结与创新  64-66
参考文献  66-74
致谢  74-75
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  75

利用扣囊复膜酵母菌A11菌株转化木薯淀粉生产海藻糖的研究

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