学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

A群轮状病毒单克隆抗体及免疫胶体金试纸条制备

作　者: 崔晓辰
导　师: 冯力
学　校: 东北农业大学
专　业: 动物学
关键词: 猪轮状病毒 单克隆抗体 胶体金免疫层析法 胶体金 ELISA
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 456次
引　用: 3次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属,是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。被PoRV感染的仔猪主要表现为腹泻、呕吐,严重者脱水,给养猪业带来严重的危害。PoRV存在多种血清型,且各个血清型之间无交叉保护或交叉保护性很差。资料显示,我国猪群中轮状病毒的感染以A群为主,在A群PoRV中VP6蛋白是群抗原,在各毒株中高度保守。目前,我国PoRV的诊断主要还是依赖于常规实验室诊断,其操作过程复杂、耗时,并且需要昂贵的仪器。因此,针对PoRV敏感性强、特异性高并能应用于现地的快速诊断方法的建立是十分必要的。本试验以A群PoRV代表株OSU毒株(G5型)为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,制备了8株抗PoRV的单克隆抗体,分别命名为1D5、1B5、1G9、1C7、3C10、1F10、1D11、1F3。ELISA结果表明,8株单克隆抗体腹水的效价分别为:1:6400、1:12800、1:25600、1:12800、1:6400、1:6400、1:25600和1:6400。类—亚类—型鉴定结果显示,1D5、1B5和1C7属于IgM类,1G9、3C10、1F10和1F3属于IgG2b亚类,1D11属于IgG2a亚类,而其轻链均为κ链。Western-blot结果表明,1D5、1G9、1C7、1F10和1D11单克隆抗体与PoRV VP6蛋白反应,1B5、3C10和1F3单克隆抗体与PoRV VP7蛋白反应。叠加ELISA结果显示,进行抗原表位的初步分析,8株单抗识别5个不同的抗原表位,即1D5和1F10单克隆抗体针对同一表位、1G9单克隆抗体针对一个表位、1C7和1D11单克隆抗体针对同一表位、1B5和1F3单克隆抗体针对同一表位、3C10单克隆抗体针对一个表位,单克隆抗体相对亲和力大小为1B5>1D11>1D5(1C7、1F10、1F3)>1G9>3C10。胶体金免疫层析技术具有快速简便、准确直观等优点,结合单克隆抗体技术又具有良好的特异性和敏感性,是目前现地应用最广泛的一种诊断方法。本试验利用抗A群PoRV OSU毒株(G5型)VP6蛋白的1G9和1D11单克隆抗体为探针制备了检测PoRV的胶体金免疫层析试纸条。利用柠檬酸三钠还原法分别制备粒径约为20 nm和40 nm的胶体金。然后用均一性好的20 nm的胶体金标记1G9的单克隆抗体(即单克隆抗体1G9︰胶体金=8.57μg︰1 mL胶体金),同时用纯化的1D11单克隆抗体(2.4μg/cm)和羊抗鼠IgG二抗(3.2μg/cm)包被M135硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,与金标垫组装成试纸条。敏感性试验结果表明,本试验制备的胶体金试纸条可以检出5.4μg/mL纯化的PoRV OSU毒株抗原和1.0×103.4 TCID50/mL病毒。在特异性试验中,用制备的试纸条对PoRV OSU毒株(G5型)、PoRV JS毒株(G9型)、牛轮状病毒NCDV毒株(G6型)、羊轮状病毒LLR-85毒株(G10型)、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒进行了检测,结果显示,PoRV OSU毒株(G5型)、PoRV JS毒株(G9型)、牛轮状病毒NCDV毒株(G6型)、羊轮状病毒LLR-85毒株(G10型)为阳性,其余均为阴性。在现地试验中,对我国部分省市37份仔猪腹泻的粪便样品进行了检测,结果表明,本试验制备的胶体金试纸条与韩国的PoRV胶体金试纸条的符合率为91.7 %(11/37,12/37)。本研究结果表明,利用抗A群PoRV OSU毒株(G5型) VP6蛋白的特异性单克隆抗体建立的PoRV胶体金免疫层析试纸条具有良好的敏感性和特异性,与国外同类试剂盒有较高的符合率。该研究结果为我国PoRV的诊断及免疫预防提供技术手段。

全文目录


摘要  10-12
Abstract  12-14
1 引言  14-31
  1.1 轮状病毒概述  14-25
    1.1.1 轮状病毒形态结构  14-15
    1.1.2 轮状病毒分类  15-16
    1.1.3 RV 的理化特性  16-17
    1.1.4 RV 基因组结构特征  17-18
    1.1.5 RV 蛋白及其作用  18-21
    1.1.6 RV 的培养特性  21
    1.1.7 发病机理  21-22
    1.1.8 防治与疫苗  22-23
    1.1.9 RV 诊断技术  23-25
  1.2 胶体金技术在免疫学检测中的应用  25-29
    1.2.1 胶体金技术在免疫学中的应用  25-28
    1.2.2 胶体金技术的优缺点  28-29
  1.3 本研究的目的和意义  29
  1.4 主要研究内容  29-31
2 材料与方法  31-50
  2.1 材料  31-36
    2.1.1 病毒与细胞  31
    2.1.2 实验动物  31
    2.1.3 阳性血清  31
    2.1.4 免疫层析材料  31
    2.1.5 主要试剂和溶液  31-36
    2.1.6 主要仪器设备及耗材  36
  2.2 实验方法  36-50
    2.2.1 病毒纯化  36-37
    2.2.2 病毒的鉴定  37
    2.2.3 小鼠免疫  37
    2.2.4 间接ELISA 检测方法反应条件的确定  37-38
    2.2.5 细胞融合  38
    2.2.6 阳性杂交瘤细胞株筛选及克隆  38-39
    2.2.7 单克隆抗体细胞株的冻存、复苏及稳定性试验  39
    2.2.8 单克隆抗体腹水的生产及预处理  39
    2.2.9 单克隆抗体的特异性鉴定  39-41
    2.2.10 单克隆抗体免疫球蛋白类—亚类—型鉴定  41
    2.2.11 杂交瘤细胞染色体分析  41
    2.2.12 单克隆抗体对应抗原表位分析  41-42
    2.2.13 单克隆抗体的纯化与鉴定  42
    2.2.14 胶体金颗粒的制备  42-44
    2.2.15 胶体金标记抗体  44-46
    2.2.16 金标垫的制备  46
    2.2.17 印膜  46-47
    2.2.18 样品垫处理液的选择  47-48
    2.2.19 样品处理液的选择  48
    2.2.20 试纸条的组装  48
    2.2.21 试纸条的检测方法和结果判定  48-49
    2.2.22 特异性试验  49
    2.2.23 灵敏性试验  49
    2.2.24 重复性试验  49
    2.2.25 稳定性试验  49
    2.2.26 现地试验  49-50
3 实验结果  50-66
  3.1 病毒纯化后的鉴定  50
  3.2 间接ELISA 反应条件的确定  50-51
  3.3 饲养细胞的制备结果  51
  3.4 骨髓瘤细胞的制备结果  51-52
  3.5 细胞融合与筛选  52-53
  3.6 杂交瘤细胞培养上清及腹水单抗效价的测定  53
  3.7 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性试验  53-54
  3.8 单克隆抗体的特异性分析  54-56
    3.8.1 PoRV 抗原捕获ELISA 试验分析  54-55
    3.8.2 IFA 检测8 株单抗与PoRV 的反应性  55-56
    3.8.3 Western-blot 分析  56
  3.9 单克隆抗体免疫球蛋白类—亚类—型鉴定  56-57
  3.10 杂交瘤细胞染色体分析  57-58
  3.11 腹水单抗饱和值测定  58
  3.12 单克隆抗体对应的抗原表位分析  58
  3.13 单克隆抗体的纯化  58-59
  3.14 胶体金的制备及粒径选择  59
  3.15 胶体金标记抗体  59-60
    3.15.1 胶体金标记抗体最适稳定量的测定结果  59-60
    3.15.2 胶体金标记抗体最适pH 的测定  60
  3.16 金标垫的制备  60-61
    3.16.1 金标单抗浓度的确定  60-61
    3.16.2 金标垫处理液的选择  61
  3.17 印膜  61-62
    3.17.1 硝酸纤维素膜的选择  61
    3.17.2 单克隆抗体1D11 及羊抗鼠IgG 二抗包被浓度确定  61-62
    3.17.3 包被液的选择  62
    3.17.4 封闭液的选择  62
  3.18 样品垫处理液的选择  62
  3.19 样品处理液的选择  62
  3.20 试纸条的组装及结果判定  62-63
  3.21 试纸条的敏感性及特异性试验  63
  3.22 试纸条重复性试验  63-64
  3.23 试纸条稳定性试验  64
  3.24 现地试验  64-66
4 讨论  66-75
  4.1 轮状病毒感染流行特点及实验动物标准化  66
  4.2 单克隆抗体的制备  66-69
    4.2.1 病毒纯化  66-67
    4.2.2 免疫方法的选择  67
    4.2.3 细胞融合  67-68
    4.2.4 间接ELISA 方法的建立  68
    4.2.5 单克隆抗体的特性鉴定及初步应用  68-69
  4.3 胶体金免疫层析诊断方法的建立  69-70
  4.4 胶体金性质  70-71
  4.5 抗体的纯化  71
  4.6 蛋白质与胶体金的吸附  71-72
  4.7 胶体金免疫层析试纸条的敏感性  72
    4.7.1 胶体金标记抗体的浓度  72
    4.7.2 膜对蛋白的吸附量  72
    4.7.3 免疫层析材料的选择  72
  4.8 胶体金免疫层析试纸条的特异性  72-73
  4.9 胶体金粒径的选择  73
  4.10 点样环境  73
  4.11 试纸条的组装及保存  73
  4.12 试纸条的检测效果及存在问题  73-75
5 结论  75-76
致谢  76-77
参考文献  77-86
附录  86-87
攻读硕士期间发表的学术论文  87

相似论文

  1. 抗吡虫啉—甲基对硫磷双特异性单克隆抗体的研究,S482.2
  2. 微纤维相关蛋白4在肝纤维化组织中的表达和外周血浓度与肝病理分级的相关性研究,R575.2
  3. 企鹅珍珠贝Cd-MT酶联免疫检测方法的建立及试剂盒的初步研制,X835
  4. 甲型流感病毒M2蛋白的表达、纯化及其免疫原性的研究,R392
  5. STLV-1病毒间接ELISA方法建立及杂交瘤细胞株的筛选,R373
  6. 鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立,S858.32
  7. 免疫磁珠纯化人呼吸道合胞病毒融合蛋白方法的建立,R373
  8. 稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,R392
  9. IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达与应用,S852.65
  10. 传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达与单克隆抗体的制备,S852.65
  11. 犬细小病毒2型VP2基因在昆虫细胞中的表达及血清抗体间接ELISA检测方法的建立,S852.65
  12. 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定,S852.65
  13. 丙草胺和乙草胺的酶联免疫吸附分析方法研究,S482.4
  14. 抗噻菌灵单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立,S482.2
  15. 氯噻啉酶联免疫吸附分析方法研究,S482.3
  16. MMP-7和溶菌酶在DSS诱导的Balb/c小鼠溃疡性结肠炎模型发病机制中的作用,S858.91
  17. 华东地区鸭圆环病毒感染流行病学调查及其单克隆抗体的制备,S858.32
  18. 猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立及NS、NP蛋白细胞定位研究,S858.28
  19. 猪TNF-α单克隆抗体制备与PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞TNF-α变化规律研究,S858.28
  20. J亚型禽白血病病毒抗体检测方法的建立及LTR体外启动活性分析,S858.31
  21. H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其AC-ELISA检测方法的建立,S855.3

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
© 2012 www.xueweilunwen.com