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PA/LFn转运系统增强机体免疫应答的初步研究

作　者: 祁永和
导　师: 王新宇；陈薇
学　校: 兰州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 炭疽毒素前列腺干细胞抗原细胞毒性T淋巴细胞肿瘤免疫
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

炭疽毒素是炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的关键性致病因子,由保护性抗原(Protective antigen,PA),水肿因子(Edema factor,EF),致死因子(Lethal factor,LF)三种毒素因子组成,PA与宿主细胞表面的炭疽毒素受体结合经一系列的相互作用后,LF/EF被PA输送进宿主细胞细胞质中,从而发挥各自的毒素效应。LFn由LF氨基端的前254aa组成,不含有LF的毒性区域,与PA具有很高的亲和结合力。基于炭疽毒素的分子结构和作用机制发展的PA/LFn转运系统,具有转运外源蛋白到胞质中激起机体特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity Tlymphocyte,CTL)杀伤反应的潜力,而CTL在清除胞内病原体和肿瘤细胞方面具有至关重要的作用。前列腺干细胞抗原(Prostate stem cell antigen,PSCA)是Thy-1/Ly-6膜抗原家族成员之一,由123个氨基酸组成的糖蛋白,具有很高的前列腺组织特异性,在前列腺癌细胞中高表达,是一种理想的前列腺癌诊断和治疗靶标。本研究选择前列腺干细胞抗原作为靶抗原,研究PA/LFn转运系统在增强机体对肿瘤抗原免疫应答的能力。本研究成功构建了pET21a-LFn-PSCA表达质粒,并在BL21(DE3)大肠杆菌中经1mM IPTG 28℃,220rpm诱导培养6h,获得可溶性高效表达,目的蛋白表达量占全菌蛋白的5%。经阴离子交换层析,Ni柱亲和层析和疏水层析三步纯化获得了较高纯度的LFn-PSCA融合蛋白,浓度为3.0mg/ml。将重组的LFn-PSCA融合蛋白与PA体外共同作用于炭疽毒素敏感细胞J774A.1小鼠巨噬细胞,结果表明重组融合蛋白对细胞没有毒性。体外竞争抑制性实验表明,LFn-PSCA蛋白可竞争性抑制LF和PA的结合,对细胞具有保护作用。将LFn—PSCA和PSCA分别在PA有无的情况下免疫小鼠,然后对小鼠产生的体液免疫和细胞免疫进行检测。借助ELISA法检测小鼠体液免疫应答水平,结果表明PA/LFn-PSCA混合免疫组小鼠血清抗PSCA抗体水平高于LFn-PSCA单独免疫组,由此推断PA可增强机体针对PSCA的体液免疫应答。但具体的增强机制仍需进行深入研究。采用MTT法分析LFn-PSCA体外刺激脾细胞增殖活性,发现PA/LFn-PSCA混合免疫组和LFn-PSCA单独免疫组均产生一定的刺激指数,但二者之间不存在统计学上的显著差异(p＞0.05)。进一步借助LDH法检测PSCA特异CTL杀伤活性,结果显示PA/LFn-PSCA混合免疫组和LFn-PSCA单独免疫组引起显著高于对照组的细胞杀伤活性(p＜0.05),但二者之间差异不显著(p＞0.05),初步认为PA未能增强机体的细胞免疫反应。目前的实验结果为我们更深入了解PA增强机体免疫应答的具体机理和发展一种新型的抗前列腺癌的蛋白疫苗奠定了理论基础,同时有助于理解炭疽致死毒素的具体作用机制。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
主要缩略语表  9-10
前言  10-17
第一部分原核表达质粒pET21a-LFn-PSCA的构建  17-25
  1 实验材料  17
  2 实验方法  17-20
  3 实验结果  20-23
  4 讨论  23-25
第二部分 LFn-PSCA在大肠杆菌中的表达及生物学活性研究  25-38
  1 实验材料  25
  2 实验方法  25-29
  3 实验结果  29-35
  4 讨论  35-38
第三部分 PA/LFn-PSCA介导PSCA的免疫应答  38-50
  1 实验材料  38
  2 实验方法  38-42
  3 实验结果  42-46
  4 讨论  46-50
小结  50-51
读研期间研究成果  51-52
参考文献  52-57
附录I 主要溶液配制  57-60
致谢  60

PA/LFn转运系统增强机体免疫应答的初步研究

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