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强的松与促皮质素药物致婴幼期脑损伤的实验性研究

作　者: 王晓宇
导　师: 蔡方成
学　校: 重庆医科大学
专　业: 儿科学
关键词: 强的松促皮质素皮质酮婴幼鼠 ACTH 未成熟脑大鼠形态学致病机理
分类号: R725.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

第一部分治疗剂量范围内强的松与ACTH 大鼠用药模型建立目的:建立在临床治疗剂量范围内强的松与ACTH的婴幼大鼠实验模型。方法:将强的松或ACTH对HPA轴的影响程度作为剂量探索的原则。①强的松剂量的确认:采集10例临床使用5天以上治疗剂量强的松患儿清晨血清标本,获得用药后平均皮质醇血浓度。再以体表面积公式换算,将24只7日龄雄性SD婴幼鼠分为:2mg/kg/d、3mg/kg/d和4mg/kg/d给药组,以及正常对照组(n=6)共4组。每日清晨8点一次性灌胃给药,连续7日,第8日清晨8点麻醉后取血,测血清皮质酮浓度。②ACTH剂量的确认:60只14日龄雄性婴幼鼠,根据给药剂量和时间分为9个实验组和1个对照组(n=6)。实验组麻醉后在三个时间点(2 pm,3 pm,3: 30pm),以大小相差40倍的3个剂量(3.8U/m~2,38 U /m~2,150 U /m~2)分别腹腔注射ACTH一次;对照组仅麻醉不给予其他干预。4pm取血测皮质酮浓度。结果:①强的松剂量的确认:10名患儿血清平均皮质醇浓度为87.18±39.71 nmol/L,其均值为正常儿童均值(552nmol/L)的15.79%。②当强的松剂量为4mg/kg/d时,大鼠皮质酮浓度降低至对照组的15.17%,与临床患儿皮质醇抑制程度相一致。③在腹腔注射大小相差40倍的不同剂量ACTH后30分钟时,婴幼鼠皮质酮水平均升高达到同一峰值,60分钟时开始下降,120分钟时各剂量组皮质酮水平均回落至基础值,与对照组无显著差异。结论:①4mg/kg/d连续7日给药后,婴幼鼠血清皮质酮浓度被抑制为正常的15%左右,与临床测试相一致,因而被确认为本研究强的松实验剂量。②与人类研究相一致,注射ACTH30分钟后,大鼠体内皮质酮增高程度不随ACTH剂量变化而显示差异。因而将临床婴儿痉挛治疗剂量按照体表面积直接换算,构建与临床治疗剂量匹配的ACTH实验大鼠模型。第二部分强的松与ACTH致婴幼期脑损伤的组织学研究目的:以健康大鼠为对照,观察不同疗程和剂量的强的松与ACTH对生后早期婴幼鼠脑发育的组织病理学影响。方法: 7日龄婴幼期和2月龄成年健康SD雄性大鼠各192只,分别给予:(1)强的松组:两年龄组各96只,分为治疗剂量组(4mg/kg/d)、小剂量组(2mg/kg/d)和对照组(赋形剂0.5%CMC),清晨一次灌胃给药;(2)ACTH组:同样分为治疗剂量组(150U/m~2/d)、小剂量组(38U/ m~2/d)和对照组(生理盐水),每日剂量分两次腹腔注射给药。每一剂量组(n=32)又分为长疗程组(3周)(n=16)和短疗程组(10天)(n=16)。分别在完成预定疗程后次日清晨(n=8)和停药4周后(n=8)留取标本,记录体重、脑重,测血清皮质酮浓度,对额叶皮层及海马切片行HE及尼氏染色,透射电镜观察海马超微结构。结果:①婴幼鼠短程治疗剂量强的松组血清皮质酮抑制程度为对照组的10.75%,短程治疗剂量ACTH组血清皮质酮升高程度为对照组的1.83倍,与第一部分的剂量预测基本一致,表明模型建立成功。②短程强的松或ACTH均导致婴幼鼠及成年鼠体重显著降低,与对照相比降低幅度在7.9～17.5%间,剂量愈大降低愈明显。停药4周后,两年龄组的体重有不同程度恢复,但仍低于对照。长程给药对体重的抑制更为明显,对婴幼鼠体重的抑制程度达20.6～37.7%。停药4周后,两年龄鼠体重均值仍较对照低9.8～23.5%。③婴幼鼠用药后发生明显脑重下降。短程用药后两药致婴幼鼠脑重降低的幅度在5.3～10.7%间,降低幅度与剂量相关。停药4周后强的松组已基本恢复正常,唯ACTH组脑重仍较对照组减低近20%。长程用药后婴幼鼠强的松组抑制幅度与短程相似,ACTH组抑制幅度高达11.7～15.9%。长程给药对成年鼠脑重也有轻度影响,抑制幅度2.2%～4.8%间。停药4周后,成年鼠脑重与对照不再有差距,但婴幼鼠两药治疗剂量组脑重仍较对照分别减低4.1%和13.2%(P<0.01)。④HE染色发现,两药短程治疗剂量与长程两剂量的婴幼鼠,以及长程治疗剂量成年鼠均可见明显的神经细胞变性及坏死,停药4周后均未再见明显组织学病变。⑤尼氏染色发现,婴幼鼠在两药物的短程和长程治疗剂量,以及长程小剂量给药时,均可见额叶皮层及海马神经细胞尼氏体减少、溶解消失现象,额叶皮层神经细胞计数较对照组明显减少,分别达25.9%～32.1%(强的松)和24.4%～29.1%(ACTH)间。停药4周后,神经细胞病变不再明显,但无论短程或长程用药,治疗剂量ACTH婴幼鼠神经细胞计数仍低于同龄对照15.8%～20.3%。无论短程或长程用药,两药均未引起成年鼠额叶皮层神经细胞形态及数量的明显异常,但在长程治疗剂量时可见海马神经细胞有尼氏体减少、溶解消失现象,停药4周后,病变不再明显。⑥透射电镜发现病变海马神经细胞染色质边集,浓缩成块状,内质网扩张,线粒体肿胀,血管周围水肿。并见髓鞘溶解变性及分层现象。停药4周后超微结构基本恢复正常。结论:①强的松与ACTH均会引起婴幼鼠和成年鼠体重明显降低。②强的松与ACTH对婴幼鼠和成年鼠脑组织均有损伤作用,但婴幼鼠更敏感。停药4周后,额叶皮层神经细胞数量仍然减少,表明激素,尤其ACTH对婴幼鼠脑组织可能造成持久性损伤。③强的松与ACTH对细胞数量的减少与脑重的降低并不平行,提示脑重的降低不仅由细胞数量减少引起,还可能涉及其他机制的作用。第三部分强的松与ACTH致婴幼期脑损伤机理的初步探讨目的:初步探讨强的松与ACTH导致脑损伤的机理。方法:实验动物及分组同第二部分。ELISA检测血清NSE,免疫组化检测额叶和海马皮层Bcl-2、Bax蛋白表达,TUNEL检测凋亡神经细胞。结果:①强的松或ACTH在治疗剂量下短程或长程给予均可致婴幼鼠血清NSE显著增高,短程组分别增高50.62%与57.34%(P﹤0.05或P﹤0.01),长程组分别增高103.23%与100.04%(P﹤0.01);成年鼠仅在两药治疗剂量下长程给药时方显著增高,分别为66.81%和60.40%(P﹤0.05)。停药4周后,各组NSE较对照组已无显著差异。②短程或长程给予两药的婴幼或成年各组额叶及海马皮层Bcl-2蛋白表达与对照组相比均无显著差异。③短程给药时Bax蛋白表达仅在两药治疗剂量婴幼组有显著增高(P﹤0.01),Bax/Bcl-2比值亦升高为对照组的1.91～2.29倍,而成年鼠则无显著增高。两药长程治疗剂量和小剂量均致婴幼组Bax蛋白在额叶和海马皮层表达显著增高,Bax/Bcl-2比值达对照组的1.92～2.70倍,而成年鼠仅治疗剂量下在海马皮层有增高。停药4周后各组Bax以及Bax/Bcl-2比值均恢复至对照组水平。④两药短程治疗剂量、长程两剂量婴幼组的额叶及海马皮层,长程治疗剂量成年组的海马皮层,均较对照组TUNEL阳性细胞表达明显增多,停药4周后均消失。结论:①除过度凋亡外,以海马为主的神经细胞坏死也是强的松与ACTH导致婴幼脑损伤的主要机制。②Bax蛋白表达和Bax/Bcl-2比值的明显增高可能是本研究中激素脑损伤中凋亡的重要启动因素。③ACTH和糖皮质激素最易引起婴幼期大脑损伤,疗程越长越严重。长程用药还可引起成年鼠脑损伤。④停药4周后脑内凋亡及坏死过程均消失。

强的松与促皮质素药物致婴幼期脑损伤的实验性研究

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