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拟南芥PP2CA2基因T-DNA插入突变体功能分析

作　者: 王婕
导　师: 郭新红；刘选明
学　校: 湖南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 拟南芥 PP2CA2基因脱落酸(ABA)信号传导生理功能
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

蛋白磷酸化是生物体中重要的信号传导方式之一。由于编码激酶/磷酸酶的基因之间存在功能重叠现象,大多数磷酸酶的功能以及蛋白磷酸化与信号传导途径的联系目前还不清楚。PP2C是蛋白磷酸酶的一个分支,其生化性质、蛋白质组成与结构都和其它磷酸酶显著不同,但在生物信号传递中扮演了重要角色,特别是在ABA信号传导中。ABA在对外界压力的响应中发挥了重大的作用。ABA参与调节植物生长发育的许多重要方面,包括种子中蛋白质和脂质的合成,促进种子的耐旱性和休眠以及抑制从胚胎发芽和植物再生转换的阶段。我们参考了许多有关PP2C的文献,发现关于PP2C基因功能的深入研究报道较少。在本研究中,我们通过筛选得到拟南芥PP2CA2基因缺失突变体的纯合子,通过“双引物法”和半定量PCR对其进行了鉴定。根据Arabidopsis.org网站提供的基因芯片结果,考察了野生型中PP2CA2基因受ABA和Nacl胁迫诱导的变化规律,结果表明,PP2CA2基因转录水平受到ABA和Nacl的诱导。我们还考察了PP2CA2基因的缺失对ABA及胁迫信号途径相关基因表达量的影响,初步确定PP2CA2基因在ABA信号传递途径中的大概位置。通过对突变体和野生型的种子萌发率,根长,气孔开度等表型的观察,以上生理学试验研究表明,突变体相对于野生型表现出对外源ABA和NaCl的低敏感。胁迫条件下给于不同浓度的ABA(0,0.1,0.3,0.6 uM)处理后,当ABA浓度大于0.3uM时,突变体种子的萌发率仍维持在60%-80%之间的范围内,而野生型种子萌发率明显低于突变体。进一步证明PP2CA2基因作用于拟南芥ABA胁迫应答信号途径,激活胁迫相关转录因子。为了更深的探讨PP2CA2基因的功能,得到正向和反向的实验证据,在已经获得T-DNA插入突变体的基础上,我们尝试构建了PP2CA2基因分段过表达株系,并对分段过表达子株系的种子萌发率,根长和气孔开度进行了测定与分析。这些研究数据为PP2C基因家族成员的生理功能分析提供了有价值的参考资料。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-15
第1章绪论  15-28
  1.1 脱落酸的生理功能与信号转导  15-20
    1.1.1 脱落酸的发现  15
    1.1.2 脱落酸在植物体内的分布及生理功能  15-16
    1.1.3 ABA 相关基因及蛋白功能  16-17
    1.1.4 ABA 与蛋白质的可逆磷酸化  17
    1.1.5 ABA 信号转导途径  17-20
    1.1.6 ABA 信号转导途径模式  20
  1.2 蛋白质的磷酸化与去磷酸化  20-25
    1.2.1 植物中的蛋白磷酸酶  20-21
    1.2.2 蛋白磷酸酶的分类以及结构特性  21-25
  1.3 环境胁迫信号传导途径之间的交互作用  25-26
  1.4 本论文研究目的、意义与内容  26-28
    1.4.1 研究目的与意义  26
    1.4.2 研究背景与内容  26-28
第2章 PP2CA2 基因缺失突变体的功能研究  28-41
  2.1 实验材料  28-29
    2.1.1 实验材料  28
    2.1.2. 拟南芥生长条件  28
    2.1.3 实验溶液配置  28-29
    2.1.4 实验仪器  29
  2.2 实验方法  29-33
    2.2.1 材料的处理和收集  29-30
    2.2.2 拟南芥总DNA 的提取PCR 鉴定  30
    2.2.3 总RNA 提取及逆转录反应  30-31
    2.2.4 引物设计  31
    2.2.5 PCR 条件的优化  31-32
    2.2.6 T-DNA 插入突变体的鉴定  32-33
    2.2.7 半定量RT-PCR  33
    2.2.8 胁迫相关基因的在突变体与野生型中的表达分析  33
    2.2.9 气孔的观察  33
  2.3 结果与讨论  33-39
    2.3.1 PP2CA2 T-DNA 插入突变体  33-34
    2.3.2 PP2CA2 T-DNA 插入突变体的鉴定结果  34
    2.3.3 PP2CA2 T-DNA 插入突变体的半定量的鉴定结果  34
    2.3.4 PP2CA2 表达量受ABA 诱导  34
    2.3.5 PP2CA2 T-DNA 萌发率表型分析  34-35
    2.3.6 PP2CA2 的根长表型分析  35-36
    2.3.7 气孔的观测  36-38
    2.3.8 胁迫相关基因在突变体和野生型中的表达情况  38-39
  2.4 小结  39-41
第3章 PP2CA2 分段过表达突变体的功能分析  41-54
  3.1 实验材料  41
    3.1.1 实验材料  41
    3.1.2 菌种  41
    3.1.3 实验溶液配置  41
  3.2 实验方法  41-48
    3.2.1 基因克隆方法  41-42
    3.2.2 目的片段的回收与纯化  42-43
    3.2.3 BP 与LR 反应  43-44
    3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备  44
    3.2.5 质粒提取  44-45
    3.2.6 菌液PCR 检测  45
    3.2.7 拟南芥转化及筛选  45-47
    3.2.8 总RNA 提取及逆转录反应  47
    3.2.9 半定量RT-PCR  47-48
    3.3.0 气孔观测方法  48
  3.3 结果与讨论  48-53
    3.3.1 目的基因的克隆  48-49
    3.3.2 转基因植株中PP2CA2 基因表达量的检测  49
    3.3.3 分段过表达植株的萌发率统计  49-50
    3.3.4 分段过表达植株的根长度统计  50-51
    3.3.5 分段过表达植株叶片下表皮的气孔观测情况  51-53
  3.4 小结  53-54
结论  54-56
参考文献  56-64
附录A:攻读学位期间所发表的学术论文目录  64-65
致谢  65

拟南芥PP2CA2基因T-DNA插入突变体功能分析

内容摘要

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