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拟南芥mTERF蛋白PDE191功能的初步研究

作　者: 张晓雷
导　师: 杨仲南
学　校: 上海师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 拟南芥白化光合色素缺失 mTERF
分类号: Q946.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

光合作用作为绿色植物所特有的生理特征,是人类以及大部分生物的物质和能量来源,是他们赖以生存、繁殖和发展的基础。叶绿体是植物进行光合作用的场所,叶绿素在植物的生长和发育中起到了关键性的作用,它吸收光能,并驱动类囊体膜电子运输。所以叶绿素缺失常常会导致白化表型和幼苗致死。因此,对叶绿体发生、发育及其功能维持方面的研究倍受关注。作为一种非常明显的形状突变,色素缺失突变体是光合系统结构、功能和调控机制的非常重要的材料。线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族是一类线粒体基因转录的重要调控因子,由核基因编码,与线粒体DNA上的特异位点结合而起作用,导致线粒体基因转录停止。近年来,随着对线粒体基因的转录机制以及人线粒体疾病研究的深入,人线粒体转录终止因子受到了普遍关注。目前,mTERF家族蛋白的基本结构已经慢慢被探索出来,但其调控线粒体转录终止的功能和机制仍有待进一步研究。在这篇文章中,我们报道了一个拟南芥色素缺失突变体pde191,表型为白化及幼苗致死。但是,当它在加入蔗糖的培养基上培养时,表现出渐渐变绿的表型。通过透射电镜我们发现pde191-1突变体的叶绿体早期发育受到严重阻碍。T-DNA插入验证,遗传连锁分析等确定该突变体为核基因控制的单基因隐性突变体,并通过等位实验和遗传互补实验证明充分证明了就是AT4G38160基因(PDE191基因)的沉默导致了植株出现白化表型。在叶片中高度表达的PDE191基因,编码了约333个氨基酸,含有7个线粒体转录终止因子结构域,具有很好的保守性,但其在不同物种中的进化关系与物种本身之间的进化关系却并不是很一致。Real-Time PCR研究了叶绿体基因的表达情况,发现和野生型相比突变体中classⅢ(依赖NEP转录的)基因的表达量都显著上调,classⅠ(依赖PEP转录的)基因的表达量均有所下调,而classⅡ(至少依赖PEP或NEP转录酶的其中一种)基因则没有很明显的趋势,说明该蛋白确实可能对质体基因转录过程产生影响。随后我们利用Northern Blot的方法研究了PDE191对质体基因转录的哪一阶段产生影响,但到目前为止还没有找到其具体作用的阶段和可能的目的基因。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 引言  8-20
  1.1 光合作用  8
  1.2 叶绿体  8-14
    1.2.1 叶绿体起源和进化  9-10
    1.2.2 叶绿体形态结构及功能  10-11
    1.2.3 叶绿体的发育  11-12
    1.2.4 拟南芥叶绿体功能基因研究进展  12-14
  1.3 植物叶色突变  14-16
  1.4 mTERF家族蛋白研究进展  16-20
    1.4.1 mTERF家族的进化  17-18
    1.4.2 mTERF家族的结构特征及功能  18-20
2 材料与方法  20-40
  2.1 实验材料  20-23
    2.1.1 植物材料  20
    2.1.2 主要仪器  20-21
    2.1.3 菌株、质粒  21
      2.1.3.1 菌株  21
      2.1.3.2 质粒载体  21
    2.1.4 抗生素  21-22
    2.1.5 培养基配方  22-23
  2.2 实验方法  23-40
    2.2.1 拟南芥的培养、种植、农杆菌转化以及转基因植株的筛选  23-24
      2.2.1.1 拟南芥的无菌培养  23
      2.2.1.2 拟南芥的种植及农杆菌的转化  23-24
      2.2.1.3 筛选拟南芥转基因植株  24
      2.2.1.4 拟南芥杂交  24
    2.2.2 T-DNA插入突变体的鉴定  24-25
    2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备  25-26
    2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的转化  26-27
    2.2.5 农杆菌感受态细胞的制备  27
    2.2.6 农杆菌感受态细胞的转化  27-28
    2.2.7 克隆载体的鉴定  28
    2.2.8 质粒DNA的少量制备碱裂解法  28-29
    2.2.9 酶切鉴定体系小量酶解反应  29
    2.2.10 连接体系的建立  29
    2.2.11 载体构建  29-31
      2.2.11.1 互补载体的构建  29-30
      2.2.11.2 亚细胞定位载体的构建  30-31
    2.2.12 拟南芥DNA和RNA的抽取  31-32
      2.2.12.1 拟南芥DNA的抽取  31
      2.2.12.2 拟南芥RNA的抽取  31-32
    2.2.13 RT-PCR和Real-Time PCR  32-33
      2.2.13.1 RNA反转录合成cDNA第一链  32-33
      2.2.13.2 半定量PCR  33
    2.2.14 原生质体导入亚细胞定位GFP载体  33-35
    2.2.15 透射电镜观察  35-36
    2.2.16 RNA印迹杂交(Northern Blot)  36-40
3 结果与讨论  40-55
  3.1 pde191-1突变体的获得及连锁分析  40-41
  3.2 pde191突变体的遗传互补实验  41-42
  3.3 突变体pde191的表型分析  42-43
  3.4 PDE191的沉默导致拟南芥叶绿体不能正常发育  43-44
  3.5 PDE191基因转录本分析  44-45
  3.6 PDE191序列分析及进化情况分析  45-48
  3.7 PDE191蛋白的亚细胞定位分析  48-49
  3.8 PDE191转录本的表达模式  49-50
  3.9 pde191突变体对质体基因表达的影响  50-51
  3.10 PDE191基因的转录终止功能初步研究  51
  3.11 讨论  51-55
    3.11.1 PDE191基因的突变导致植株白化致死  52
    3.11.2 PDE191基因是叶绿体生长发育的必须基因  52-53
    3.11.3 PDE191是mTERF蛋白家族的一员  53-54
    3.11.4 PDE191蛋白的缺失对质体基因转录的影响  54-55
参考文献  55-60
致谢  60-62

拟南芥mTERF蛋白PDE191功能的初步研究

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