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猪链球菌多重PCR检测方法的建立及屠宰场样品感染率的调查研究

作　者: 郑升博
导　师: 华修国；崔立
学　校: 上海交通大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌 血清型 毒力因子 多重PCR 斑马鱼 半数致死量(LD50)
分类号: S855.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


猪链球菌(Streptococcus suis, SS)是一种重要的人兽共患病原菌,主要引起猪和人类的脑膜炎、败血症及突发性死亡,对养猪业造成巨大损失的同时,严重威胁人类公共卫生安全。根据菌体荚膜多糖抗原特性的不同,可分为35个血清型(1～34型,1/2型),其中以2型流行最广、致病性最强,其次是7型和9型。目前研究认为SS致病性与其相关毒力因子的携带与表达密切相关。本研究首先根据标准菌株建立多重PCR方法并对方法进行评价,随后根据所建立方法初步设计了检测试剂盒;应用本研究所建立的多重PCR方法对分离自扁桃体样品中的猪链球菌进行分型与毒力因子的检测,并用斑马鱼模型对12株SS2的致病力进行了比较。一、猪链球菌2、7、9型多重PCR检测方法建立与应用根据相关文献及Genbank上猪链球菌序列,设计合成10对引物,通过在3个PCR反应体系中的组合优化,建立了一种涵盖7种猪链球菌主要毒力因子mrp、epf、sly、gdh、gapdh、orf2和fbps及2、7、9型分型的多重PCR检测方法。特异性和敏感性试验结果表明该法特异性强,多重PCR敏感性可达103CFU。最后根据所建立方法设计组装试剂盒并拟定操作说明书,通过重复性试验和保存期试验,证明试剂盒的批内、批间重复性好,可在-20℃条件下保存4个月。二、扁桃体样品中猪链球菌的调查与2型分离菌株的毒力比较2008年-2009年期间,分别在上海、安徽和广东三地屠宰场采集屠宰后猪的扁桃体样品,对所采399份样品中猪链球菌的携带率以及血清分型进行PCR检测。结果显示SS总体阳性率(16S rRNA+)为9.27% (37份);分离到23株SS。其中2型有16株、7型有3株和9型有4株;14份(3.5%)样品16S rRNA阳性但具体血清型待定。所有2型分离菌株中,有9株毒力因子表型为mrp+epf+fbps+gdh+orf2+sly+ gapdh+;其它分离菌株均存在不同毒力因子缺失。随后选用800多尾斑马鱼(Danio rerio)对上述9株2型分离菌株以及SH-07YH、ZY05719和HA9801共计12株细菌致病力进行比较。结果斑马鱼接种细菌12h后呈败血症病变,96h内的半数致死量(LD50)在9.07×103至1.02×105CFU之间。从死亡的斑马鱼体内可分离到的细菌,经革兰氏染色和PCR验证均证实为SS2。另外PBS对照组接种后96h内不表现任何病变,亦无死亡。结果表明斑马鱼对SS2强致病株易感。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
符号说明  13-14
第一章 文献综述  14-33
  1 猪链球菌病研究概况  14-15
  2 病原学  15-16
  3 流行病学  16-17
  4 临床症状及病理变化  17-18
  5 毒力因子  18-24
  6 致病机理  24-25
  7 诊断学  25-29
  8 动物模型  29-30
  9 预防及控制  30-33
第二章 猪链球菌2、7、9 型多重PCR 检测方法的建立与检测试剂盒的初步设计  33-44
  1 材料  33-34
    1.1 菌株  33
    1.2 主要试剂及仪器  33-34
  2 方法  34-37
    2.1 菌种培养  34
    2.2 模板的制备  34
    2.3 PCR  34-36
    2.4 试剂盒的重复性试验与设计组装  36-37
  3 结果  37-42
    3.1 PCR 结果  37-40
    3.2 试剂盒的重复性试验结果与设计组装  40-42
  4 讨论  42-44
第三章 屠宰场猪群扁桃体中猪链球菌的检测与2 型分离菌株的毒力比较  44-57
  1 材料  44-45
    1.1 菌株  44
    1.2 斑马鱼  44-45
    1.3 主要试剂及仪器  45
  2 方法  45-46
    2.1 扁桃体样品的采集  45
    2.2 菌种培养  45
    2.3 模板的制备  45
    2.4 PCR  45-46
    2.5 细菌的分离鉴定  46
    2.6 斑马鱼的分组接种及病变观察  46
    2.7 半数致死量（LD_(50)）的测定  46
    2.8 死亡后斑马鱼体内细菌的分离与鉴定  46
  3 结果  46-53
    3.1 16S rRNA 检测结果  46-47
    3.2 分型检测结果  47-48
    3.3 细菌分离结果  48
    3.4 毒力因子检测结果  48-50
    3.5 病理变化  50
    3.6 LD_(50) 的计算结果  50-53
    3.7 细菌的分离与鉴定  53
  4 讨论  53-57
第四章 结论  57-58
附录Ⅰ试剂配制  58-59
附录 Ⅱ 猪链 、7、9 分型与毒力因子多重PCR检测试球菌 2 剂盒操作说明书  59-61
参考文献  61-70
致谢  70-71
攻读学位期间发表的学术论文目录  71-74
上海交通大学硕士学位论文答辩决议书  74

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 细菌病 > 球菌
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