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DNA损伤修复相关蛋白表达与辐射剂量关系的研究

作　者: 张庆芝
导　师: 闵锐；樊春海；宋世平；李雨；倪瑾
学　校: 第二军医大学
专　业: 放射医学
关键词: ATM蛋白电离辐射生物剂量计纳米生物探针
分类号: Q345
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

准确快速测定人员吸收剂量在放射伤员的分类诊断和临床治疗、肿瘤患者的精准化和人性化放射治疗、放射生物学效应研究、特殊辐射环境人员健康危害评价等领域都有重要作用和意义,是当今放射医学和辐射防护学研究的一项重要内容。物理方法测定辐射场剂量和个体的吸收剂量直接而准确,具有权威性。但在未佩带个人剂量计和未安装现场剂量监测计等情况下,用物理方法检测剂量十分艰难,这不仅因为准确检测需要花大量时间重建辐射现场,更因为有时辐射现场根本无法模拟和重建。因此,在一些特殊或突发情况,用物理方法检测人员受照剂量很难做到。用生物分析的方法来评估人员受照剂量虽有许多优势,是未来发展的方向,但仍存在许多待解决的科学和技术问题,问题的关键在于如何筛选出敏感、特异能反映生物受照剂量的一系列生物指标,及在此基础上建立准确可靠、灵敏快速的分析方法技术。随着新理论、新方法和新技术的运用,一些在基因和蛋白水平具有发展潜力的新生物剂量标志物不断被发现和报道。以ATM蛋白为代表的DNA损伤修复相关蛋白的含量和活化程度的改变与辐射剂量间的量效关系就是目前研究的热点之一。ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated)是一种在感应和传递DNA损伤信号、启动损伤DNA修复中起着重要作用的蛋白,其活化程度与DNA损伤程度存在依赖关系,当发生DNA损伤时,ATM蛋白自身被磷酸化,同时激活并调节一系列与DNA修复相关的蛋白,包括H2AX, RAD50, NBS1, Mre11, CHk1、2, c-AB1等,导致这些重要功能蛋白聚集在DNA损伤和断裂的部位,实现与DNA损伤部位的连接,使修复顺利进行。文献报道0.25Gy照射后30分钟即可见ATM蛋白的活化信号,4Gy照射后3小时仍可检测到较高强度的ATM蛋白活化荧光灶(foci)。然而,过去检测ATM活化大都采用免疫荧光的方法直接对细胞内的蛋白进行染色分析,此方法虽直观,但需要通过大量细胞观察并对其荧光强度进行识别和统计才能对ATM活化量进行半定量检测,这种方法难以实现对辐射剂量的准确快速定量分析,尤其是在低照射剂量范围蛋白活化信号较弱的场合。因此,针对ATM等蛋白检测在生物剂量计研究中的应用,需要一种能直接定量和灵敏特异的检测方法。生物传感器是近年来发展较快的一种特异、灵敏的生物分子检测技术,纳米材料因其良好的生物相容性和独特的光学性质,已经在DNA传感器等领域得到广泛应用。本研究以化学或生物修饰的纳米材料为载体,以醛基磁珠表面修饰的ATM单抗捕获样品中的ATM抗原,通过在反应体系中加入ATM多抗形成单抗-抗原-多抗的夹心结构,通过纳米生物探针实现信号放大输出,建立可对溶质中fg量级ATM蛋白进行灵敏、特异检测的方法,实现对目标蛋白的灵敏、特异检测。与传统方法比,这种检测方案有可能使受评估的剂量范围更低。由于不同探针设计实现检测的方法不同,各有利弊,本研究在对一系列纳米生物探针,如IgG-纳米金-DNA探针,IgG-纳米金-HRP探针,摸索筛选的基础上寻找更简便易行、稳定可靠的检测策略-IgG-纳米碳管-HRP探针。研究内容根据筛选探针的不同,主要研究内容分为三部分：一、基于IgG-纳米金-HRP探针的方法检测ATM蛋白二、基于IgG-纳米碳管-HRP探针的方法检测ATM蛋白三、基于IgG-纳米金-DNA探针的RCA方法研究步骤一、纳米金和纳米碳管探针的制备分别调节纳米金溶液的PH致所加蛋白的等电点附近和将纳米碳管表面的羧基用EDC和NHS活化,将0.005mg/ml的IgG和1mg/ml的HRP分别加入到准备好的纳米金或纳米碳管中,室温反应过夜,BSA封闭,离心洗涤去掉未结合反应的蛋白,用储存液(0.5%casein)重悬沉淀即为纳米探针。二、制备探针的验证在包被有ATM蛋白的多克隆抗体的醛基磁珠体系中加入制备的探针,通过检测探针上的二抗和磁珠上的多抗是否发生特异性显色反应,验证探针表面两种蛋白连接的成败和生物活性。三、利用探针检测目标蛋白将ATM单克隆抗体加入到醛基化磁珠中,25℃下孵育1h,洗涤除去游离蛋白,加入封闭液37℃反应1h,封闭醛基磁珠表面可能存在的空白活性位点。封闭结束后,PBST (150mM PBS,0.25%Tween20)洗涤3min×2次,加入ATM抗原溶液至蛋白标记的磁珠溶液中,37℃轻微振荡反应1h。PBST洗涤3minx2次,然后各加入ATM多克隆抗体,37℃下轻微振荡反应1h。PBST洗涤3minx2次,加入制备好的探针溶液,37℃下再次孵育1h,实现抗原抗体的免疫反应连接。结束后,PBST洗涤3minx4次,加入TMB(含H2O2)室温孵育2～3min,变色完全并稳定后,酶标仪测光吸收值,收集数据并分析。四、数据处理用SPSS11.0分析软件进行数据统计分析,一维方差分析法进行显著性检验(以P<0.05为差异显著)。利用origi8.0制作各图表。方法检测限的确定标准为将阴性对照均值加上三倍阴性对照的标准偏差设为阈值,信号高于此值的浓度即为该方法的最低检测限。方法的特异性从实验组与阴性对照组信号差别的量级上体现。本研究的初步结果：制备出IgG-纳米金-DNA探针,IgG-纳米金-HRP探针和IgG-纳米碳管-HRP探针三种具有生物活性的纳米生物探针,经比较分析纳米碳管生物探针基本能满足标准体系中对ATM蛋白特异、灵敏和可重复性的检测。初步结论：与检测蛋白的经典ELISA方法和其他生物传感器探针技术比,本研究采用的纳米碳管探针信号放大的检测策略,在未增加实验步骤的情况下,保留了生物传感器信号充分放大的特点,而检测的稳定性优于IgG-纳米金-DNA探针和IgG-纳米金-HRP探针生物传感器探针策略,可实现对低于1pg/ml ATM蛋白的特异、灵敏检测。

全文目录

缩略词  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-16
第一部分基于IgG-纳米金-HRP探针的方法检测ATM蛋白  16-21
  材料  17
  方法  17-18
  结果  18-20
  讨论  20-21
第二部分基于IgG-纳米碳管-HRP探针的方法检测ATM蛋白  21-30
  材料  21
  方法  21-24
  结果  24-29
  讨论  29-30
第三部分基于IgG-纳米金-DNA探针的RCA检测方法  30-35
  材料  30-31
  方法  31-32
  结果  32-34
  讨论  34-35
全文总结  35-37
附录  37-54
参考文献  54-61
综述  61-69
文献发表  69-70
致谢  70

DNA损伤修复相关蛋白表达与辐射剂量关系的研究

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