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辐射可诱导基因Gadd45和p21～（WAF1）作为辐射生物剂量计的实验室评估

作　者: 刘斌
导　师: 郑晓飞
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 电离辐射电离辐射生物剂量计荧光实时定量PCR Gadd45 p21WEAF1
分类号: Q345
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

辐射生物剂量计在核事故受害者受照剂量估算及辐射生物学效应研究中具有重要的应用价值。在半个多世纪的研究中，被筛选过的指标有近百种，但经实践验证具有实用价值的却不多。理想的电离辐射生物剂量计应具备的特点包括，①具有电离辐射可诱导性；②与照射剂量显示有较好的剂量—效应关系；③取样方便，如人外周血、尿、头发等；④方法简便，测定快速等。迄今为止尚没有一种现有的生物剂量计能完全符合这些要求。电离辐射诱发的基因表达变化与被照细胞的生物学反应密切相关。其中辐射可诱导基因Gadd45（growth arrest DNA damage inducible）的剂量效应尤为引人关注。美国陆军放射生物研究所的体外研究工作表明，受电离辐射照射后，人外周血中Gadd45 mRNA水平迅速升高，且mRNA水平与照射剂量存在较好的剂量—效应关系。尤其是Gadd45 mRNA在电离辐射后变化速度快、易于检测，这一特点正是现有的生物剂量计所欠缺的。而在受照早期对照射剂量进行快速估算对于照射受害者的诊断和治疗至关重要。由此，Gadd45能否发展成为一种新的GEC型（Gene Expression Changes）电离辐射生物剂量计成为生物剂量领域追踪的热点。迄今为止，关于Gadd45剂量—效应关系已有的研究，都是基于对单个血液样本所做的检测。而要将Gadd45最终发展为成熟的生物剂量计，个体间的Gadd45 mRNA水平的差异是必须要考察的一个因素。同时，已有研究所使用的方法也都要求有未照射样本作为对照来评价照射样本中Gadd45 mRNA水平的变化幅度。但通常照射事故的病人是小可能留有自身未照射的血液样本。所以建立一种能够在电离辐射后无需对照，而能准确、快速通过检测受照样本Gadd45 mRNA水平估算受照剂量的方法也是亟需解决的难题。针对上述两个问题，本研究首先建立了相对标准曲线法类型的实时定量PCR方法，用β-肌动蛋白（β-actin）作为内对照基因，对电离辐射后Gadd45的变化规律进行研究。建立了Gadd45 mRNA水平变化最明显的照射后4小时0-2.5Gy范围内的剂量—效应回归方程（y=0.216+0.258x，R²=0.650）。统计学分析表明，由此剂量—效应回归方程推算照射剂量时的精确性尚不能达到令人满意的水平。为了寻找新的GEC观测指标，以期得到精确性更高的剂量—效应曲线，我们在进一步研究中改用电离辐射后基因表达升高幅度更为明显的p21^WAFI作为研究对象，并且由照射后表达下降的c-myc替代传统的内对照基因β-actin。建立了照后4小时p21^WAFI／c-myc组合0-2.5Gy范围内的剂量—效应回归方程（y=0.482+0.773x，R²=0.855），此回归方程显示出比Gadd45／β-actin回归方程更好的精确度。此前，关于p21^WAFI作为辐射生物剂量计的可行性研究尚未见报道。总结上述研究，我们建立了相对标准曲线法类型的实时定量PCR方法，并由这一方法建立了Gadd45／β-actin和p21^WAFI／c-myc的剂量—效应刻度曲线。应用此方法和剂量—效应刻度曲线，成功地解决了照射事故的病人缺乏自身未照射血液样本的问题。此外，我们对使用Gadd45／β-actin和p21^WAFI／c-myc作为生物剂量计时个体差异所产生的影响进行了评估。应用我们建立的剂量—效应标准曲线和相对标准曲线法类型的实时定量PCR大致能够对实验条件下0-2.5Gy范围内的血液照射样本的剂量进行估算。将Gadd45和p21^WAFI发展为可实用的生物剂量计向前推进了一步。

辐射可诱导基因Gadd45和p21～（WAF1）作为辐射生物剂量计的实验室评估

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