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南疆地方品种绵羊myostatin基因克隆及真核表达

作　者: 金波
导　师: 李树伟
学　校: 塔里木大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 南疆绵羊肌生成抑制素真核表达
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

1997年,美国约翰霍普金斯大学McPherron和Lee的研究小组发现了myostatin基因,即控制超级牛大小性状的基因。myostatin,也称为生长分化因子-8（growth and differentiation factors-8, GDF-8, MSTN）,可抑制骨骼肌生长,是肌肉生长负调控因子。敲除该基因的转基因小鼠和该基因的突变的双肌牛均表现为更多的肌肉量。本研究旨在构建南疆地方品种绵羊（和田羊平原型、和田羊山区型、卡拉库尔羊、多浪羊）肌生成抑制素基因的真核表达载体,并在真核细胞中进行表达。从而为筛选能稳定表达MSTN的细胞株,寻找肌生成抑制素的作用受体打下良好的基础。本研究利用现代分子生物学技术,从绵羊骨骼肌中提取从南疆地方品种绵羊骨骼肌中提取得到总RNA。扩增出MSTN-cDNA片段,与pMD18-T载体相连接,转化E.coli DH5α。通过PCR、酶切鉴定及序列分析,成功地选到阳性克隆。根据GenBank上发表的绵羊肌生成抑制素（MSTN）基因cDNA序列（GenBank登录号：NM₀01009428.1）,利用DNA Star软件分析设计一对引物（008F,008R）,在上下游引物中分别引入XhoⅠ,PstⅠ的酶切位点,并去除终止密码子。MSTN cDNA为模板,PCR扩增MSTN基因,与pMD-18T载体连接,将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性质粒,经PCR和酶切鉴定,成功地构建了南疆地方品种绵羊pMD-18T-HS-MSTN、pMD-18T-HP-MSTN、pMD-18T-KL-MSTNpMD-18T-DL-MSTN克隆质粒,并进行测序分析,结果与设计一致。将克隆质粒与真核表达载体pEGFP-N1同时双酶消化,回收的MSTN目的片段及pEGFP-N1载体片段,将目的片段插入真核表达载体pEGFP-N1的XhoⅠ和PstⅠ酶切位点之间,转入CaCl2法制备的感受态细胞中,筛选阳性真核表达重组子,并测序分析,构建了南疆地方品种绵羊MSTN基因的真核表达质粒pEGFP-N1-HS-MSTN、pEGFP-N1-HP-MSTN. pEGFP-N1-KL-MSTN、pEGFP-N1-DL-MSTN。采用脂质体法转染真核细胞CHO,将南疆地方品种绵羊MSTN基因全长375个氨基酸与绿色荧光蛋白在CHO细胞中进行融合表达,并通过荧光显微镜观察确认。

南疆地方品种绵羊myostatin基因克隆及真核表达

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