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抗EV71病毒VP2单克隆抗体的制备及鉴定

作　者: 沈俊娅
导　师: 范骏
学　校: 浙江大学
专　业: 临床检验诊断
关键词: EV71 VP2 单克隆抗体制备鉴定
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景：肠道病毒71型(Entero virus 71, EV71)感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑脊髓膜炎等多种疾病,并可引起严重的中枢神经系统并发症或致死性肺水肿。自1969年首次报道以来,EV71已经在世界范围内引起了十多次暴发流行,包括澳大利亚、东南亚和欧洲。众多血清型的肠道病毒在生物表现型与分子构成中具有相同的特性,因此其是否存在共同抗原及其位点存在于何处,已引起国内外众多的关注。衣壳蛋白在病毒感染及诱导机体免疫反应中起重要作用,国内外有许多研究致力于EV71衣壳蛋白及其抗体在基因分型和疫苗研制方面的应用。研究目的：制备能敏感且特异地识别EV71衣壳蛋白VP2的单克隆抗体,为今后临床检测EV71提供物质基础,并为EV71疫苗的制备及基础研究提供有力保障。实验方法：以GenBank公布的EV71 VP2序列和参考文献为基础,利用计算机辅助设计,确定并人工合成抗原多肽,并用Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH)交联以增强多肽的免疫原性。用合成的EV71衣壳蛋白VP2抗原多肽免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤融合技术和有限稀释法制备抗EV71 VP2单克隆抗体。将筛选获得的单抗细胞株注射BALB/c小鼠腹腔,收获腹水大量制备单抗,用亲和纯化法纯化抗体。采用ELISA法、免疫细胞化学染色法、免疫印迹Western-blot和免疫沉淀法(IP)鉴定单克隆抗体的效价、反应特异性和敏感性。实验结果：采用杂交瘤技术,获得4株针对人工合成的EV71衣壳蛋白VP2抗原多肽的特异性单克隆抗体。抗体亚类鉴定为IgGl型；用ELISA测定制备的单抗效价,纯化的单抗效价在1×105-1×106之间；免疫细胞化学染色法鉴定结果显示制备的单克隆抗体能够与EV71衣壳蛋白特异性地结合。以EV71病毒临床分离株为抗原,与纯化的单克隆抗体进行Western-blot和免疫沉淀分析显示,抗EV71衣壳蛋白VP2单克隆抗体与EV71临床分离株的制备蛋白反应后在相对分子质量约40KD处出现1条清晰条带,说明所制备的单克隆抗体可识别含有抗原肽靶位的EV71,证明制备的单抗具有良好的特异性。结论：本研究制备的抗EV71衣壳蛋白VP2单克隆抗体能敏感且特异地识别EV71衣壳蛋白。该抗体在今后EV71感染的诊断、治疗、疫苗制备、病毒的结构功能研究以及抗体分析等方面具有良好的应用前景。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-10
目次  10-11
1 引言  11-12
2 材料与方法  12-29
  2.1 材料  12-18
  2.2 方法  18-29
3 结果  29-35
  3.1 融合后杂交瘤细胞生长状况  29
  3.2 杂交瘤细胞株建立  29-30
  3.3 单克隆抗体纯化结果  30-31
  3.4 单克隆抗体效价及亚类鉴定  31-32
  3.5 免疫细胞化学染色法鉴定结果  32-33
  3.6 Western-blot鉴定结果  33-34
  3.7 免疫沉淀法鉴定结果  34-35
4 讨论  35-39
5 结论  39-40
参考文献  40-42
综述  42-50
作者简历及在学期间发表的文章  50

抗EV71病毒VP2单克隆抗体的制备及鉴定

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